In-vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen unter Verwendung des Hanging-Drop-Methode

Summary

Dieses Video zeigt, wie in vitro-Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus, um Embryoidkörpern mit dem hängenden Tropfen-Methode durchzuführen.

Abstract

Stammzellen haben die bemerkenswerte Potenzial, sich in viele verschiedene Zelltypen zu entwickeln. Wenn eine Stammzelle teilt, jede neue Zelle die Möglichkeit, entweder eine Stammzelle bleiben oder zu werden eine andere Art von Zelle mit einer spezialisierten Funktion hat, ist dieser viel versprechenden wissenschaftlichen führenden Wissenschaftler auf die Möglichkeit der zell-basierte Therapien zur Behandlung von Krankheiten zu untersuchen. Wenn Kultur in Suspension ohne antidifferentiation Faktoren, embryonalen Stammzellen spontan zu differenzieren und bilden dreidimensionale vielzelligen Aggregaten. Diese Zellaggregate heißen Embryoidkörpern (EB). Hanging drop Kultur ist ein weit verbreitetes EB Bildung Induktion Methode. Die abgerundeten unteren hängenden Tropfen ermöglicht die Aggregation von ES-Zellen, die bieten mES Zellen können ein gutes Umfeld für die Bildung EBs. Die Zahl der ES-Zellen in einem hängenden Tropfen aggregatied kann durch Variation der Anzahl der Zellen in der ersten Zellsuspension als ein Tropfen aus dem Deckel der Petrischale aufgehängt werden gesteuert werden. Mit dieser Methode können wir reproduzierbar Form homogener EBs aus einer vorgegebenen Anzahl von ES-Zellen.

Protocol

Verkleistern T75 Kolben unter Verwendung einer 0,1% igen Gelatinelösung und inkubieren Platte in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator über Nacht einen Tag vor. Nehmen Sie die MES-Zellen aus inkubieren, absaugen des Mediums, spülen Sie die ES Zellkultur mit PBS, fügen 0,05% Trypsin-Lösung zur Beschichtung der Boden der Schale (2 ml/100mm Platte). Bei 37 ° C für ca. 1 Minute, bis die Zellen Häutung sind von der Platte. Vorsichtig verreiben (Pipette nach oben und unten) die t…

Discussion

Die Nachteile der hängenden Tropfen-Methode sind wie folgt: das flüssige Volumen eines Tropfens auf weniger als 50ul begrenzt durch die Aufrechterhaltung hängende Tropfen auf dem Deckel durch die Oberflächenspannung, und es ist unmöglich, das Medium für hängende Tropfen zu ändern. Die Beobachtung der Bildung von EBs in Tropfen direkt mit der Mikroskopie ist auch sehr schwierig während der Kultivierung. Weiter mehr, der hängende Tropfen-Methode aus zwei Schritten besteht, kann daher eine Reihe von Schritt des hängenden Tropfen Met…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM	Reagent	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS)	Reagent	Hyclone	SH30070.03
L-Glutamine	Reagent	Gibco	25030
Non-Essential Amino Acids	Reagent	Gibco	11140-050
Penicllin / Streptomycin	Reagent	Gibco	15140-122
Sodium Pyruvate	Reagent	Gibco	11360-70
β-mercaptoethanol	Reagent	Chemicon	ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF)	Reagent	Chemicon	LIF2005
96-well ultralow attachment plate	Tool	Corning	3474