Assay ההתנהגות כדי למדוד את התגובה של דג הזברה לשינויים לעוצמות אור
Summary
פיתחנו את תגובת חזותית-Motor כדי לכמת את הפלט המוטורי של דג הזברה הזחל בתגובה במרווחים ו decrements אור. בחנו גם מוטנטים דג הזברה חזון, כולל לא optokinetic (NRC) מוטנטים בתגובה, אשר נחשבו עיוור לחלוטין, כאשר נבדק על ידי assay אחר חזון, רפלקס optokinetic.
Abstract
רפלקס optokinetic (OKR) היא של Visual Basic רפלקס הוצגו על ידי רוב בעלי החוליות ואת ממלא תפקיד חשוב בייצוב עין יחסית למקום חזותית. עם זאת, OKR מחייב חיה לזהות פסים נעים יתכן כי דגים אינם תערוכה OKR לא יכול להיות עיוור לחלוטין. דג הזברה מוטציה אחת, תשובה ג optokinetic (NRC) אין OKR בכל תנאי אור נבדק נמסר להיות עיוור לחלוטין. בעבר הראינו כי OFF-הגנגליון פעילות התא יכול להיות מוקלט מוטנטים אלו. כדי לקבוע אם דגים מוטנטים עם OKR אין כמו מוטציה NRC יכול לזהות במרווחים של אור פשוט decrements פיתחנו את assay חזותי מנוע התנהגותיות (VMR). ב assay זה, זחלים דג הזברה יחיד ממוקמים היטב בכל צלחת 96-היטב המאפשר ניטור סימולטני של הזחלים באמצעות מערכת אוטומטית, מעקב וידאו. התגובות של תנועה של כל זחל עד 30 דקות אור ו -30 דקות את האור הוקלטו לכימות. דגים WT יש עלייה קצרה של פעילות מוטורית על האורות דולקים, המכונה תגובת בהלה, ואחריו לחזור נמוכה מאשר פעילות המחקר, שנקרא להקפיא. דגים WT גם להגביר את הפעילות של תנועה חדה שלהם מיד לאחר כיבוי האורות, ורק בהדרגה (מעל מספר דקות) לחזור לפעילות בסיסית של תנועה. מוטנטים NRC להגיב באופן דומה אור OFF כמו דג WT, אבל התערוכה ירידה קלה בפעילות הממוצעת שלהם לעומת דגים WT. פעילות מוטורית בתגובה אור ב NRC מוטנטים מתעכב ועכור. יש זמן עלייה איטית של התגובה NRC מוטציה לאור ON לעומת אור WT על התגובה. תוצאות המחקר מראות כי דגים NRC אינם עיוורים לגמרי. מכיוון teleosts יכול לזהות אור דרך אי – רשתית רקמות, אנו אישר כי תגובות התנהגותיות מיידית אור עוצמת השינויים דורשים עיניים שלם באמצעות (chk) מוטנטים chokh, אשר לחלוטין חוסר העיניים החל מהשלבים המוקדמים של הפיתוח. ב assay VMR שלנו, מוטנטים chk התערוכה אין תגובת בהלה לאור או כבוי, מראה כי בעיני לרוחב לפשר התנהגות זו. Assay VMR המתואר כאן משלים את assay ומבוססת OKR, אשר אינו לבחון את היכולת של הזחלים דג הזברה להגיב לשינויים בעוצמות אור. בנוסף, אוטומציה של assay VMR ניתנת ההקרנה תפוקה גבוהה עבור פגמים עוצמת אור מונע תגובות חזותית.
Protocol
Discussion
הפרוצדורות אנחנו מראים בסרט הם כל נציג של דגים WT. עם זאת, הניסויים הללו ניתן לעשות זאת באנלוגיה על דגים מוטנטים, כמו גם (ראה סעיף נציג תוצאה). אנו ממליצים על צלחת דגים WT דגים מוטנטים על הצלחת באותו מתווה לוח דמקה למטרות שליטה אופטימלית.
בעת שימוש דגים מוטנ…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים EY0081 ו 5T32UY07145 ועל ידי קרן האבירים הטמפלרים העין. ג'ייסון Rihel הוא עמית Bristol-Squibb של מדעי החיים Research Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Microplate devices | Tool | Whatman | 7701-1651 | |
| Transfer pipetes | Tool | VWR | 202205 | |
| Fish water | Reagent | refer to reference #4 | ||
| Recording chambers (Zebrabox) | Tool | Viewpoint Lifesciences | ||
| Videotrack Software | Tool | Viewpoint Lifesciences |
References
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , (2000).
