Etiquetado selectiva de las proteínas de la superficie celular con CyDye DIGE Colorantes Fluor mínimo

Summary

Un método sencillo y específico se ha demostrado para el etiquetado fluorescente y mejorar la detección de las proteínas de la superficie celular sin una etapa de fraccionamiento. Abundancia diferencial de proteínas de superficie celular se analizó mediante electroforesis bidimensional (2-D) y Ettan ™ tecnología DIGE.

Abstract

Proteínas de superficie son esenciales para la capacidad de las células para reaccionar a su entorno e interactuar con las células vecinas. Son conocidos por ser inductores de casi toda la señalización intracelular. Además, juegan un papel importante en la adaptación del medio ambiente y tratamiento de drogas, y están a menudo involucrados en la patogénesis de la enfermedad y la patología (1). Interacciones proteína-proteína son intrínsecos a las vías de señalización, y para obtener mayor conocimiento en estos procesos biológicos complejos, los métodos sensibles y fiables son necesarios para el estudio de las proteínas de la superficie celular. De dos dimensiones (2-D) de electroforesis es ampliamente utilizado para la detección de biomarcadores y otras metas, en las muestras de proteínas complejas para estudiar los cambios diferenciales. Proteínas de superficie celular, en parte debido a su baja abundancia (un 2% de las proteínas celulares), son difíciles de detectar en un gel 2-D sin fraccionamiento o algún otro tipo de enriquecimiento. También están a menudo mal representados en geles 2-D, debido a su naturaleza hidrofóbica y de alto peso molecular (2). En este estudio, se presenta un nuevo protocolo para las células intactas utilizando CyDye DIGE tintes Fluor mínimos para el etiquetado específico y la detección de este importante grupo de proteínas. Los resultados mostraron un etiquetado específico para un gran número de proteínas de superficie celular con un mínimo de etiquetado de las proteínas intracelulares. Este protocolo es rápido, fácil de usar, y los tres CyDye DIGE tintes Fluor mínima (Cy 2, 3 y Cy Cy 5) puede ser utilizada para etiquetar las proteínas de la superficie celular. Estas funciones permiten la multiplexación mediante la electroforesis en 2-D de fluorescencia Gel Diferencia (2-D DIGE) con Ettan tecnología DIGE y el análisis de los cambios de expresión de la proteína usando DeCyder 2-D software de análisis diferencial. El nivel de las proteínas de la superficie celular se siguió durante la privación de suero de las células CHO durante distintos períodos de tiempo (ver Tabla 1). Los pequeños cambios en la abundancia se detectaron con gran precisión, y los resultados se definen con el apoyo de métodos estadísticos.

Protocol

De cultivo celular Crecer las células de ovario de hámster chino (CHO-K1), utilizando los procedimientos estándar de cultivo celular en medio Ham F-12 con glutamax que contiene 10% de suero fetal bovino, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen). Cambio del medio de cultivo a medio libre de suero. Etiqueta de proteínas de la superficie de la célula fueron en diferentes momentos con CyDye DIGE Fluor Cy3 o Cy5 tintes mínima (ver sección de etiquetado de …

Discussion

Concentración de proteínas

Una visión general de los dos flujos de trabajo de etiquetado se muestra en la Figura 1. Dado que las células están intactas cuando una etiqueta según el protocolo de la proteína de la superficie celular de etiquetado, sólo las proteínas de superficie de las células son expuestas a la tintura. En el protocolo estándar Ettan DIGE, las células se lisan antes de su etiquetado y las proteínas dentro como fuera de la célula están etiquetados (Fig. 1). La ca…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
CyDye DIGE Kit, 2 nmol	Reagent	GE Healthcare	28-9345-30
2-D Quant Kit	Reagent	GE Healthcare	80-6484-51
IPG Buffer pH 3-11NL	Reagent	GE Heallthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm	Reagent	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Tool	GE Healthcare	28-9334-65
IPGbox kit	Tool	GE Healthcare	28-9334-92
DeStreak Rehydration solution	Reagent	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Instrument component	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster	Tool	GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit	Instrument	GE Healthcare	80-6466-46	230 V unit: 80-6466-27
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	Instrument	GE Healthcare	63-0055-81
Ettan Spot Picker	Instrument	GE Healthcare	18-1145-28
Ettan Digester	Instrument	GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
DeCyder 2-D Differential Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant Analysis Software	Other	GE Healthcare	28-9236-62
Urea	Reagent	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagent	GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Dithiothreitol (DTT)	Reagent	GE Healthcare	17-1318-01
Bromophenol Blue	Reagent	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagent	GE Healthcare	17-1321-01
Sodium Dodecylsulfate (SDS)	Reagent	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glycerol 87%	Reagent	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagent	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagent	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Ammonium Persulfate	Reagent	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Glycine	Reagent	GE Healthcare	17-1323-01
2-D Sample Prep for membrane proteins	Reagent	Pierce	89864
Streptomycin sulphate	Reagent	Invitrogen	15140-122