Raccolta di sangue dal Granchio Ferro di Cavallo Americano, Limulus Polifemo

Summary

Il granchio americano a ferro di cavallo, Limulus polyphemus, è probabilmente la fonte più conveniente per grandi quantità di sangue di qualsiasi invertebrati. Il sangue è semplice nella composizione, con un solo tipo cellulare nella circolazione generale, il Amebocyte granulare, e solo tre proteine ​​abbondanti nel plasma, hemocyanin, il C-reattiva proteine, e α2-macroglobulina. Il sangue viene raccolto dal cuore e le cellule del sangue e del plasma sono separate per centrifugazione.

Abstract

Il granchio a ferro di cavallo è il miglior sistema caratterizzato immune di lunga durata invertebrati. Lo studio di immunità in granchi a ferro di cavallo è stata agevolata dalla facilità nella raccolta di grandi volumi di sangue e dalla semplicità del sangue. Granchi a ferro di cavallo mostrano solo un unico tipo di cellule nella circolazione generale, il Amebocyte granulare. Il plasma è il contenuto di sale dell'acqua di mare e solo tre proteine ​​abbondanti, hemocyanin, la proteina respiratoria, il C-reattiva proteine, che funzionano nella distruzione citolitica di cellule estranee, comprese le cellule batteriche, e α2-macroglobulina, che inibisce la proteasi di patogeni. Il sangue viene raccolto da diretto puntura cardiaca in condizioni che riducono al minimo la contaminazione da lipopolisaccaride (aka, endotossina, LPS), un prodotto di batteri Gram-negativi. Un animale di grandi dimensioni può produrre 200-400 ml di sangue. Per lo studio del plasma, le cellule del sangue vengono immediatamente eliminati dal plasma per centrifugazione e il plasma può essere frazionato nelle sue proteine ​​costituenti. Le cellule del sangue sono opportunamente studiate al microscopio attraverso la raccolta di piccoli volumi di sangue in LPS-free soluzione salina isotonica (0,5 M NaCl) in condizioni che consentono l'esame microscopico diretto mettendo uno dei più LPS-free vetrini sulla superficie del piatto di cultura, poi quelli di montaggio vetrini nelle camere di semplice osservazione a seguito dell'adesione cellulare. Una seconda preparazione per l'osservazione diretta è quella di raccogliere 3 – 5 ml di sangue in una LPS-free piatto embrione e poi espianto frammenti di amebociti aggregati ad una camera che il tessuto sandwich tra una diapositiva e il coprioggetti. In questa preparazione, il amebociti mobili migrare sulla superficie coprioggetti, dove possono essere prontamente rilevate. Il sistema di coagulazione del sangue comporta l'aggregazione di amebociti e la formazione di un coagulo extracellulare di una proteina, coagulin, che viene rilasciata dai granuli secretori delle cellule del sangue. Analisi biochimica delle cellule del sangue lavate richiede che l'aggregazione e la degranulazione non si verifica, che può essere realizzato attraverso la raccolta di sangue in 0,1 volumi pari al 2% Tween-20, 0,5 M NaCl LPS-free, seguita da centrifugazione delle cellule e lavaggio con 0,5 M NaCl.

Protocol

Caratteristiche anatomiche del granchio a ferro di cavallo rilevanti per sanguinamento (Fig. 1) Figura 1 Le tre divisioni principali del corpo, da anteriore a posteriore, sono i Prosoma (P), il opisthosoma (O), e il telson (T) 1. I margini anteriore e laterale libera del Prosoma è la flangia. Il pos…

Discussion

Ci sono quattro specie di granchio a ferro di cavallo, Polifemo Limulus dalla costa orientale del Nord America e tre le specie che spaziano dal Giappone al Golfo del Bengala. L'animale è identificato come un "fossile vivente", perché le forme anatomicamente simili sono stati trovati come fossili da 445 milioni di anni fa ^27. Il granchio a ferro di cavallo rappresenta un longevo animale, che richiede 10 – 13 anni per raggiungere la maturità e la vita almeno 20 anni ^28. Anche se è stato sottopo…