Ceci est un guide pour modifier la forme de micropipettes de verre. Plus précisément, en utilisant la chaleur et la pression d'air du cône est élargi sans pour autant augmenter l'ouverture astuce, conduisant à une plus faible résistance pipette. Cela est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit de petites cellules, mais est utile dans de nombreuses applications.
Abstract
Pression de polissage est une méthode pour façonner des pipettes en verre pour patch-clamp. Nous avons d'abord développé cette méthode pour la fabrication de pipettes approprié pour l'enregistrement de petite taille (<3 m) des corps cellulaires neuronaux. Le principe de base est similaire à soufflage du verre et combine la pression de l'air et la chaleur de modifier la forme de pipettes de patch préparé par un extracteur micropipette conventionnels. Il peut être appliqué aux soi-disant douces (chaux sodée) et durs (borosilicate) lunettes. De manière générale le polissage de pression, peut réduire la résistance pipette de 25% sans diminuer le diamètre de l'ouverture pointe (Goodman et Lockery, 2000). Il peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type de verre et ne nécessite que l'ajout d'une vanne à haute pression et à équiper une microforge. Cette technique est indispensable pour l'enregistrement à partir des cellules ultrapetites (<5 m) et peut également améliorer canal unique d'enregistrement en minimisant la résistance pipette. La forme émoussée est également utile pour l'enregistrement de pince-patch perforé puisque cette forme de la pointe des résultats dans une bulle plus grande membrane disponible pour la perforation.
Protocol
Pipettes de traction En utilisant un filament extracteur comme une Sutter P-97 Extracteur microélectrodes Flaming / Brown, tirer un ensemble d'environ 10-20 pipettes. Sélectionnez votre verre. Nous utilisons borosilicate (BF150-86-10, DO = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Conservez le verre avec soin afin qu'il reste propre et sans poussière. Concevoir un programme de traction. L'objectif principal est une astuce ouverture d'environ la taille désirée, ce qui dépendra de l'appl…
Discussion
Nous avions d'abord développé cette méthode pour faire des pipettes utile pour patch-clamp 2-3 um neurones en C. elegans1. C'est dans l'utilisation de routine dans le laboratoire de Goodman. Pipettes pression polonaise Nous avons non seulement pour l'enregistrement à partir de minuscules C. neurones elegans, mais aussi pour l'obtention d'enregistrements macropatch et un seul canal des canaux ioniques exprimés dans des ovocytes de Xenopus. Pour une donnée pointe de l'ou…
Acknowledgements
La technique de la pression de polissage a été développé en collaboration avec Lockery SR.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Glass Capillaries
Consumable
Sutter Instruments
BF150-85-10 (or similar)
The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope
Microscope
Leica
DM IL (or similar)
Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit
Tool
ALA Science
CPM-2
Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source
Tool
ALA Science
PR-60
Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve
Tool
Cole-Parmer
A-98150-01
Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector
Tool
World Precision Instruments
MPH-6S20
Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing
Tool
Cole-Parmer
06408-62
Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve
Johnson, B. E., Brown, A. L., Goodman, M. B. Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording. J. Vis. Exp. (20), e964, doi:10.3791/964 (2008).