Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

Ciao, sono Jody del laboratorio, Steven Hallam del Dipartimento di Microbiologia in immunologia dell'Università della British Columbia. Oggi vi mostreremo una procedura per l'estrazione del DNA genomico, concentrato da campioni di acqua di mare su filtri STX da 0,2 micron e una purificazione di questo DNA mediante una centrifugazione in gradiente di densità di cloruro di cesio. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per ottenere DNA ambientale in modo da poter studiare la struttura, la diversità e il metabolismo della comunità microbica negli ambienti marini.

Quindi iniziamo. Inizia questo protocollo scongelando su ghiaccio, l'agitazione dei filtri X che hai precedentemente concentrato con biomassa planctonica, trattati con lisi, tampone e congelati per semplicità. Qui descriviamo la procedura per l'elaborazione di un singolo filtro.

In pratica, si consiglia di elaborare 15 o meno filtri alla volta. Una volta scongelato il filtro, iniziare la prima delle due incubazioni. Uno per licitare le cellule e rimuovere l'RNA e uno per abbattere le proteine.

Per la prima incubazione, aggiungere 100 microlitri di lisozima e 20 microlitri di RN a al filtro. Richiudere il filtro con il profumo e lasciarlo ruotare a 37 gradi Celsius per un'ora. Per la prossima incubazione, aggiungere 100 microlitri di proteina ace KN 100 microlitri 20% SDS al filtro.

Richiudere il filtro con perfil e lasciarlo ruotare per una o due ore in più. Questa volta a 55 gradi. Utilizzare una siringa da cinque cc per trasferire il lisato dal filtro Stax a un tubo di falco da 15 millilitri.

Sciacquare il filtro con un millilitro di tampone di lisi e aggiungere il liquido di risciacquo al lisato nel tubo del falco. Ora che hai lisato e digerito le tue cellule, sei pronto per estrarre il loro DNA. Il passo successivo consiste nell'utilizzare il metodo del cloroformio fenolo per estrarre il DNA dal lisato.

Aggiungere un volume uguale di circa tre millilitri di fenolo cloroformio, alcol isoamilico al vortice del tubo di lisato. Per 10 secondi per mescolare bene, girare il tubo a 2, 500 volte G per cinque minuti. Durante la centrifugazione, la miscela di lisato di cloroformio fenolo deve separarsi in due strati.

Uno strato organico sul fondo contenente il fenolo, il cloroformio e le proteine del campione. E uno strato acquoso di solito sopra, che consiste nell'acqua del DNA e in altre molecole più idrofile. Trasferisci lo strato acquoso contenente il tuo DNA in una nuova provetta Falcon da 15 millilitri A questa provetta, aggiungi un volume uguale di un vortice di miscela di alcol isoamilico cloroformio per 10 secondi.

Questo passaggio rimuove il fenolo residuo dal campione di DNA. Centrifugare 2, 500 volte G per cinque minuti o fino a quando lo strato acquoso non è limpido. Trasferire lo strato acquoso in una nuova provetta di falco etichettata e aggiungere un millilitro di TE a PH otto.

Ora hai il tuo estratto di DNA. Il passo successivo consiste nel lavare e concentrare il campione di DNA in una provetta da ultracentrifuga Amazon da 15 millilitri. Trasferisci il tuo campione di DNA nello scomparto del filtro di anon.

I tubi theon Ultra Tube sono costituiti da un filtro che trattiene le molecole a un peso molecolare specificato o superiore, il tate e un tubo per catturare il flusso attraverso il filtrato. In questo caso, il filtro mantiene la rotazione del DNA a 3.500 volte G per 10 minuti. Verificare che ci sia meno di un millilitro di liquido trattenuto nel filtro Amon.

Se rimane più ritenzione Tate, riempire nuovamente il filtro con TE e girare di nuovo. Rimuovi il flusso attraverso o filtra in un altro tubo di falco e conservalo in frigorifero fino a quando non hai confermato il tuo prodotto finale su un gel, aggiungi due millilitri di tampone TE al filtro Amazon e centrifuga a 3.500 volte G per sei minuti. Rimuovere il filtrato come prima.

Lavare il DNA altre due volte con TE per un totale di tre lavaggi, conservando il filtrato ogni volta per l'ultima centrifuga fino a quando rimangono da 200 a 500 microlitri di Tate nel filtro Amon. Annotare il volume finale e trasferirlo in una provetta da 1,5 millilitri etichettata. Preparare un'aliquota di 70 microlitri del DNA concentrato lavato da utilizzare come materiale di lavoro.

Conservare il materiale di lavoro a meno 20 gradi Celsius. Congela il resto del DNA a meno 80 gradi Celsius. Controlla la concentrazione e la qualità del DNA del tuo prodotto finale facendo scorrere i campioni su un gel accanto al DNA.

Le scale, che fungono da standard di dimensioni e intensità, impostano un gel AROS allo 0,8% più bromuro di aterio per funzionare durante la notte. Nelle prime corsie caricare scale con bande di vari pesi molecolari e concentrazioni, si consiglia il seguente schema di carico. Nelle prime due corsie, caricare 10 microlitri di un kilobyte più la scala nelle tre corsie successive, caricare due microlitri, cinque microlitri e 10 microlitri rispettivamente di 50 nanogrammi per microlitro Lambda H tre scale.

Infine, caricare cinque microlitri per corsia di campione di estratto di DNA. Far funzionare il gel a 15 volt per circa 16 ore. Fotografa il gel utilizzando il sistema di documentazione UV su gel per determinare l'intervallo di peso molecolare del tuo DNA e la sua concentrazione.

Confrontare le bande campione con le bande della scala. Il DNA di buona qualità avrà un alto peso molecolare e mostrerà poche prove di taglio o degradazione. Se la qualità del DNA è buona e la quantità è sufficiente, procedere alla purificazione del DNA eseguendo un gradiente di cloruro di cesio.

Prima etichetta di centrifugazione, una provetta da centrifuga per ogni campione a ciascuna provetta da centrifuga, aggiungere 160 milligrammi di cloruro di cesio e 178 microlitri di DNA genomico. Coprire il tubo con un pezzetto di perfil e capovolgere delicatamente il tubo da 10 a 20 volte per mescolare i componenti. Non miscelare mediante pipettaggio che potrebbe causare il taglio del DNA.

Quindi aggiungere 10 microlitri di AUM bromuro al tubo e mescolare di nuovo. Assicurarsi che le provette siano ben bilanciate prima della centrifugazione e che le differenze di peso tra le provette siano inferiori a un milligrammo. Inserire le provette nel rotore dell'ultracentrifuga utilizzando le forbici a pinzette.

Quindi chiudere il coperchio del rotore e posizionare il rotore all'interno dell'ultracentrifuga vicino. Il vuoto della porta dell'ultracentrifuga verrà applicato non appena si chiude la porta. Funziona durante la notte per un totale di 18 ore a 100.000 giri/min a 20 gradi Celsius.

Al termine della centrifugazione, estrarre le provette dal rotore con le forbici a pinzetta e posizionarle sulla griglia. Portate i tubi al transluminatore a luce blu, indossate i bicchieri con filtro ambrato. Quindi accendi la luce blu e guarda la tua banda di DNA usando una siringa sterile da un cc n ago.

Rimuovere la banda di DNA e quindi posizionarla in una provetta da 1,5 millilitri per aiutare a recuperare la maggior parte del DNA intrappolato nello spazio morto nella siringa. Sciacquare la siringa con 100 microlitri te e aggiungere la soluzione di risciacquo al tubo. Preparare una provetta con 100 microlitri di tampone per campione per evitare la contaminazione incrociata.

Per rimuovere il bromuro AUM dal DNA, aggiungere un volume uguale di butanolo saturo d'acqua al tubo. Capovolgere delicatamente le provette, centrifugare da 10 a 20 volte a 10.000 giri/min per un minuto e scartare lo strato superiore. Ripetere il lavaggio circa tre o quattro volte fino a quando il colore del butanolo non è trasparente.

Mettere quattro millilitri di TE in una provetta da ultracentrifuga ancon e aggiungere la soluzione di DNA dalla centrifuga a 3, 500 volte G a temperatura ambiente fino a quando il volume del DNA non si riduce a circa 100-500 microlitri e scartare il flusso. Aggiungere due millilitri di TE al filtro Amazon e centrifugare a 3.500 volte G per sei minuti. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi con il concentrato fino a un volume finale da 50 a 100 microlitri mediante centrifugazione aggiuntiva, se necessario.

E trasferire la soluzione di DNA sul filtro in un nuovo tubo einor da 1,5 millilitri. Aggiungere 40 microlitri di te al filtro theon e pipettare su e giù lungo entrambe le membrane del filtro per lavare via il DNA residuo. Aggiungere questa soluzione alla provetta di DNA concentrato.

Posizionare un'unità filtrante MicroCon YM 30 in una provetta MicroCon e prelavare il MicroCon aggiungendo 200 microlitri di acqua in autoclave e centrifugando a 10.000 giri/min per sette minuti. Aggiungere la soluzione di DNA al MicroCon prelavato per concentrare ulteriormente la centrifuga di DNA a 5.000-10.000 volte G per uno o tre minuti. Controllare la quantità di liquido sul filtro e ripetere la centrifugazione fino a quando la quantità di liquido sul filtro non si riduce a circa 50 microlitri.

Posizionare l'unità filtro capovolta in una nuova provetta MicroCon e centrifugare a 1000 volte G per tre minuti. La quantità ideale di soluzione concentrata è compresa tra 50 e 60 microlitri. Trasferisci il tuo campione di DNA in una nuova provetta da 1,5 millilitri.

Misura la concentrazione di DNA su un NanoDrop e controlla la qualità del picco. Un grafico delle assorbanze per il DNA pulito dovrebbe avere un picco chiaro a 260 nanometri. Congela il resto del DNA a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si dovrebbe vedere un'immagine su gel simile alla figura uno La concentrazione effettiva di DNA degli estratti varia a seconda della fonte del campione. Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si dovrebbe vedere chiaramente una banda di DNA al centro del tubo. Come nella seconda figura, vi abbiamo appena mostrato come estrarre il DNA genomico dai filtri sterex e purificarlo utilizzando un gradiente di densità di cloruro di cesio.

Quando si esegue questa procedura, è importante verificare prima di iniziare di disporre di tutti i reagenti necessari e degli oggetti di consumo. E in secondo luogo, pianifica almeno tre giorni interi per avere tutto il tempo necessario per completare attentamente la procedura. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.