双光子激光诱导神经损伤：观察 阿 克逊退化和再生的方法

- 首先在玻璃盖下安装一个干净的麻醉幼虫，头部向上滑动。接下来，通过轻轻推盖滑来滚动幼虫并调整其位置来暴露感兴趣的区域。使用共焦成像定位幼虫神经细胞。确定目标神经细胞上的特定轴向作为损伤部位。

然后，将目标轴向暴露在双光子激光下，其功率高于用于成像以诱导损伤的功率。 双光子激光器的使用是因为它能够穿透并精确定位活组织内的损伤，对周围组织的伤害最小。

当目标神经元受损，导致轴切除术或轴素分离时，立即停止激光照射。最后，对受伤的神经元进行成像，以查看其退化和随后在所需时间点再生。

在示例协议中，我们将安装幼虫进行显微镜检查，诱导幼虫感官神经元的损伤，并跟踪神经再生。

-从麻醉幼虫开始。 在烟熏罩中，将一个60 毫米的玻璃盘放入 15 厘米的塑料培养皿中。 然后折叠一张纸巾，放在玻璃盘中。 加入二乙醚后，将葡萄糖板放在组织上。

接下来，在玻璃滑梯上放置一滴卤素27油在中心， 并在四个角落各放置一个真空润滑脂点。 然后使用钳子将一个幼虫转移到阿加板上，并盖上玻璃盘对幼虫进行麻醉。熔岩停止移动后，小心地将其转移到头部直立的卤烃油中。然后在滑梯上放置一个盖子滑动，轻轻按压，直到它接触到幼虫。

接下来，使用温和的力滑动盖滑动，将细胞滚动到双光子激光最容易击中它们的地方。位置会因神经元的目标而异。 现在，请在双光子显微镜阶段固定组装，并使用 40 倍油浸入目标专注于感兴趣的细胞。

在软件中，切换到扫描模式并加载保存的协议。确保针孔一直打开。然后，在实时模式下，获得感兴趣区域的良好图像。

接下来，停止实时扫描，以便作物按钮可用。 使用作物功能，调整扫描窗口，将目标区域聚焦在潜在的损伤部位上，然后打开一个新的成像窗口。现在降低扫描速度，增加激光强度。然后切换连续按钮开始并停止扫描。小心观察。一旦荧光急剧增加，就结束扫描。

接下来，切换回原始成像窗口并选择实时模式，并通过调整对焦查找刚刚定位的区域。

- 伤害成功的一个好迹象是损伤现场出现一个小陨石坑、环状结构或局部碎片。如果激光功率过高，就会看到大面积的损坏区域，这可能是致命的。

-现在小心地取下盖子，用酵母糊将受伤的幼虫转移到新盘子里。将盘子放入60毫米的盘子中，并加入丙酸浸泡的组织，然后将盘子恢复到培养温度。

对于幼虫的后续成像，请使用保存的共焦设置，并收集具有 25 倍目标的 z 堆栈图像。请务必包括规范化点，以便对再生进行量化。