Encyclopedia of Experiments: Biology
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- पहले पॉली-lysine के साथ लेपित एक गिलास स्लाइड पर तरल में धोया सी ईlegans स्थानांतरण, एक यौगिक जो कांच की सतह से चिपके रहने में मदद करेगा। धीरे-धीरे एक और ग्लास स्लाइड को सीधे नीचे की ओर दबाएं। बिना किसी क्षति के कीड़े को स्थिर करने के लिए, किसी भी पार्श्व गति से बचने वाले जानवरों को संकुचित करें। फिर, एक इंसुलेटेड प्रयोगशाला कंटेनर के अंदर एक धातु ब्लॉक पर सैंडविच वाले कीड़े के साथ ग्लास स्लाइड रखें, जैसे तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ।
धातु एक प्रभावी तापमान कंडक्टर है जो यह सुनिश्चित करता है कि ब्लॉक सतह दोनों कांच की सतहों पर कृमि के क्यूटिकल को तेजी से फ्रीज करने के लिए काफी ठंडा है। एक बार जम जाने के बाद, कृमि क्यूटिकल को खोलने या क्रैक करने के लिए ग्लास स्लाइड को तेजी से अलग करें। टिश्यू फिक्सेशन के साथ आगे बढ़ें और कम पारग्लीबिलिटी क्यूटिकल के व्यवधान के रूप में धुंधला होने से रासायनिक फिक्सेटिव और धुंधला एंटीबॉडी आंतरिक कृमि ऊतकों तक पहुंचने की अनुमति देता है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम फ्रीज-क्रैकिंग तकनीक और ऊतक निर्धारण का विस्तृत प्रदर्शन देखेंगे ।
- सबसे पहले, कीड़े को ठीक करने के लिए एक स्लाइड तैयार करें। एक स्लाइड पर पॉली-एल-लिसाइन के पिपेट 30 माइक्रोलीटर, एकnd फिर, दूसरी स्लाइड पर एक दूसरी स्लाइड सेट करें और उन्हें एक साथ रगड़ें ताकि दोनों पर समान रूप से समाधान फैलाया जा सके। अब, दो स्लाइड को छील लें और उन्हें 30 मिनट के लिए सूखी हवा दें।
इसके बाद, तरल नाइट्रोजन से भरे कंटेनर में एक फ्लैट मेटल ब्लॉक रखें। प्लेटों को M9 समाधान से धोएं और कीड़े युक्त M9 के लगभग 10 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, कीड़े को चुनें और स्लाइड में M9 जोड़ें।
एक बार जब कीड़े स्थानांतरित हो जाते हैं, तो धीरे-धीरे उन पर एक कवरस्लिप क्रॉसवे छोड़ दें ताकि कवर्लिप एक किनारे को ओवरहैंग करे। फिर, किसी भी पार्श्व आंदोलनों को बनाए बिना धीरे-धीरे कवरस्लिप दबाएं।
अब, तुरंत स्लाइड को तरल नाइट्रोजन में मेटल ब्लॉक में स्थानांतरित करें और इसे फ्रीज कर दें। पांच मिनट के बाद, ओवरहैंगिंग एज का उपयोग करके कवरस्लिप को झटका दें। क्यूटिकल की उचित दरार प्राप्त करने के लिए इसे तेजी से करें।
इसके बाद, एक मेथनॉलसे भरे ग्लास कॉपलिन जार में माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड विसर्जित करें । पांच मिनट के बाद, स्लाइड को एक एसीटोन सेभरे ग्लास कॉपलिन जार में एक और पांच मिनट के लिए एक और तापमान पर स्थानांतरित करें । स्लाइड सीधे दाग या शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
