Einzelzelldissoziation von Caenorhabditis elegans: Eine Methode, um lebende Zellen zu isolieren

- Beginnen Sie mit gewaschenen pelletierten Würmern und fügen Sie Lysepuffer mit SDS, einem Reinigungsmittel, und DDT, einem Reduktionsmittel. Dies bricht die Schützenhaut des Wurms, die den Körper für die Zelldissoziation aussetzt. Vermeiden Sie eine längere Exposition gegenüber dem Lysepuffer, um Zelllyse und Tod zu minimieren.

Als nächstes entfernen Sie die Lyse-Reagenzien mit mehreren Waschungen des Kaltisolationspuffers. Es ist wichtig, dass dieser Puffer von der richtigen Osmolarität ist, um den Zelltod zu verhindern. Verwenden Sie ein Protease-Enzym, um Zell-zu-Zell-Verbindungen zu abbauen. Helfen Sie den Homogenisierungsprozess zusammen mit mechanischer Energie, indem Sie das Gemisch gegen die Rohrwand pfeifen.

Fügen Sie Medien mit Serum hinzu, um die Enzymreaktion und Antibiotika zu stoppen, um eine Kontamination zu verhindern. Pellet und waschen Sie die Probe mehrmals, um den größten Teil des Schmutzes zu entfernen.

Schließlich legen Sie die Röhre auf Eis, um die Schwerkraft sedimentation zu ermöglichen. Trümmer, einschließlich Reste der Nagelhaut oder Zellklumpen werden sich aussetzen, während dissoziierte Zellen in der oberen Schicht der Medien hängen bleiben. Diese Zellen können für die kurzfristige Kultivierung oder zur Isolierung bestimmter Zellpopulationen durch FACS oder Immunpräzipation verwendet werden.

Im Beispielprotokoll werden wir transgene Würmer dissoziieren, die GFP in Neuronen von Interesse ausdrücken, um diese Zellen zu isolieren und zu analysieren.

- Zentrifugieren Sie die Tiere nach dem Sammeln fünf Minuten lang bei 1.600 mal g. Entfernen Sie alle Überstande und setzen Sie die Würmer in 1 Milliliter M9-Medien wieder auf. Übertragen Sie die Suspension auf ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.

Zentrifuge bei 1.600 mal g für fünf Minuten, um die Würmer zu pellet. Dann fügen Sie 200 Mikroliter SDS-DDT Puffer und inkubieren bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Die Würmer sollten nun entlang des Körpers gefaltet scheinen, wenn unter einem Lichtmikroskop betrachtet.

Als nächstes fügen Sie 800 Mikroliter eiskalten Isolationspuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie das Rohr sanft flicken. Zentrifuge bei 13.000 mal g und bei 4 Grad Celsius für eine Minute, um die Würmer zu pellet. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie mit 1 Milliliter Isolationspuffer.

Wiederholen Sie diesen Zentrifugations- und Waschprozess insgesamt fünfmal, wobei Sie sicherstellen, dass der Isolationspuffer jedes Mal sorgfältig entfernt wird. Danach 100 Mikroliter Proteasemischung aus Streptomyces griseus, gelöst im Isolationspuffer, in das Pellet geben.

Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Minuten. Achten Sie darauf, mechanische Störungen anzuwenden, indem Sie 60 bis 70 Mal mit der 200-Mikroliter-Mikropipette-Spitze gegen den Boden des Rohres auf und ab pfeifen. Um das Stadium der Verdauung zu bestimmen, entfernen Sie 1 bis 5 Mikroliter des Verdauungsgemisches, lassen Sie es auf eine Glasrutsche fallen und inspizieren Sie es mit einem Gewebekulturmikroskop.

Nach fünf bis sieben Minuten sollten Wurmfragmente eine sichtbar reduzierte Nagelhaut haben und eine Gülle der Zellen wird gut sichtbar sein. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 900 Mikroliter des kommerziell erhältlichen Leibovitz-Mediums L15 hinzufügen, das mit 10% FBS und Penicillin-Streptomycin ergänzt wird.

Zentrifuge bei 10.000 mal g und bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten, um isolierte Fragmente und Zellen zu pellet. Waschen Sie die Pelletzellen zweimal mehr mit kalten L15 ergänzten Medien mit 1 Milliliter Medien pro Wäsche. Setzen Sie die pelletierten Zellen in 1 Milliliter L15 ergänztMedien und lassen Sie auf Eis für 30 Minuten.

Nehmen Sie dann die oberste Schicht, die etwa 700 bis 800 Mikroliter beträgt, und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenrohr. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer, um die Zelldichte von 10 bis 25 Mikroliter isolierter Zellen zu messen.