Decellularizing Mammary Fat Pads: Afledning ekstracellulære Matrix Hydrogels fra Mammary Fat Pads

Først skal du placere brystfedtpuder eller MFP'er i en skål med Trypsin-EDTA-opløsning og inkubere i den ønskede varighed for at bryde cellematrixen vedhæftninger. Vask MMFP'erne med deioniseret vand og stamme gennem en si. Placer væv i et bægerglas med en rørestang og tilsæt Triton X-100. Rør til lyse celler uden at påvirke vækstfaktorerne i vævets ekstracellulære matrix.

Strain MFP'er og skyl med deioniseret vand. Overfør væv tilbage til bægeret, og tilsæt deoxycholic syre til lyse de resterende celler. Derefter skal du belaste MMFP'erne og placere dem i et bægerglas, der indeholder deioniseret vand, med penicillin-streptomycin for at forhindre kontaminering. Inkubat bægeret ved 4 grader Celsius natten over.

Strain MMFP'er og læg dem i et bægerglas, der indeholder ethanol og perdikesyre. Perdikesyren øger stivheden af vævets ekstracellulære matrix. Rør rundt i et stykke tid og gentag anstrengende trin. Vask MMFP'erne med PBS og derefter med deioniseret vand. De anstrengte MMFP'er overføres til et bægerglas, der indeholder propan-1-ol.

Rør i nogen tid, stamme indholdet, og vask MMFP'er med deioniseret vand. Tør MFP'erne og opbevar ved minus 80 grader Celsius. I den følgende protokol vil vi udføre afcellulariseringen af murine mammary fedtpuder.

Først skal du placere MFP'erne i seks centimeter retter med fem milliliter Trypsin-EDTA-opløsning. Spray og tør opvasken med 70% ethanol og inkuber ved 37 grader Celsius i en time. Brug 0,7 millimeter sien til at vaske MMFP'erne med deioniseret vand ved at hælde vand over vævet tre gange. Brug pincet til manuelt at massere vævet i mellem vasker.

Dernæst kort tørre vævet på en delikat opgave tørre og veje det. De tørrede væv anbringes i et præ-autoklaveret bægerglas, der indeholder en passende størrelse rørestang, og vævene dækkes med 60 milliliter 3% t-octylphenoxy polyethoxyethanol pr. gram væv. Rør i en time ved stuetemperatur. Derefter dumpe bægerglas indhold i en si.

Skyl bægeret med deioniseret vand og hæld dette på vævene. Gentag denne skylning proces to gange mere, og sørg for at bruge pincet til manuelt at massere vævet i mellem skylninger. Derefter tørres vævet kortvarigt på en delikat opgavetørring og vejer. Placer væv og rørestænger tilbage i de samme bægerglas og dække dem med 60 milliliter 4% deoxycholic syre per gram væv. Rør ved stuetemperatur i en time.

Derefter dumpe bægerets indhold i en maske si. Skyl bægeret med deioniseret vand og hæld dette på vævene. Gentag denne skylning proces to gange mere, og sørg for at bruge pincet til manuelt at massere vævet i mellem skylninger. Tør kort det skyllede væv på en delikat opgavetørring og vej det.

Placer det tørrede væv i samme bægerglas sammen med frisk deioniseret vand suppleret med 1% penicillin streptomycin. Dæk bægeret tæt med paraffinfilm og lad det stå ved 4 grader Celsius natten over. Den næste dag skal du dræne bægerindholdet i en si. Tør kort vævet på en delikat opgave tørre og veje det. Placer derefter MFP'erne i samme bægerglas med en passende størrelse rørestang.

Dæk vævet med 60 milliliter af en opløsning, der indeholder 4% ethanol og 0,1% perdikesyre pr. gram væv. Rør ved stuetemperatur i to timer. Smid bægerets indhold i en 0,7 millimeter si. Brug tang til manuelt at massere vævet og placere indholdet tilbage i bægeret. Vask vævet ved at dække det med 60 milliliter 1X PBS pr gram væv.

Rør ved stuetemperatur i 15 minutter. Gentag hele denne vaskeproces en gang til. Derefter dump bægerets indhold i en 0,7 millimeter si. Brug pincet, manuelt massere vævet og placere indholdet tilbage i bægeret. Vask vævet ved at dække det med 60 milliliter deioniseret vand pr. Gram væv.

Rør ved stuetemperatur i 15 minutter. Gentag hele denne vaskeproces en gang til. Tør kortvarigt det vaskede væv på en delikat opgavetørring og vej det. Dump væv og indhold i en si og bruge pincet til manuelt at massere vævet. Placer indholdet tilbage i bægeret og dække væv med 60 milliliter 100% n-propanol per gram væv.

Rør ved stuetemperatur i en time. Tør derefter kortvarigt vævet på en delikat opgavetørring og vej det. Dump væv og indhold i en 0,7 millimeter si og bruge pincet til manuelt at massere vævet. Placer indholdet tilbage i bægeret og vask vævet ved at dække det med 60 milliliter deioniseret vand pr. Gram væv.

Rør ved stuetemperatur i 15 minutter. Gentag denne vaskeproces tre gange. Derefter tørres vævet kortvarigt på en delikat opgavetørring og vejer det. Overfør vævet til et mærket 15 milliliter rør og frys ved negative 80 grader Celsius natten over.