만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서 이미징

HIV에 감염된 성인 환자의 경우 신경염증이 정상적인 시냅스 신호를 방해하여 추상화, 언어 유창성, 주의력 학습, 새로운 정보 및 기억의 어려움을 포함하는 신경인지 결핍을 유발합니다. HIV 1 tat은 염증 분자의 분비를 유도하는데, 이는 HIV 환자에서 볼 수 있는 시냅스 기능 장애를 모방할 수 있습니다. microglia를 포함하여 단핵 세포에서 GFP를 발현하는 성체 마우스는 얇은 두개골 2 광자 현미경을 사용하여 HIV 1 tat 유도 신경 염증을 조사하는 데 사용됩니다.

tat 주입 후 미세아교세포의 반응은 in vivo에서 이미지화할 수 있습니다. 결과 이미지는 미세아교세포돌기의 단축 및 두꺼워짐과 식세포컵과 같은 구조의 형성뿐만 아니라 대뇌 미세혈관에서의 말초 단핵구 이동을 보여줍니다. 안녕하세요, 저는 로체스터 대학의 신경 발달 및 질병 센터(Center for Neural Development and Disease)와 해리스 갈바드(Harris Galbard) 연구실의 댄 마커(Dan Marker)입니다.

안녕하세요, 저는 로체스터 대학교 신경생물학 및 해부학과 에스카 연구소의 EF 트롬블리입니다. 안녕하세요, 저는 Albas Lab의 Shain Luu입니다. 오늘은 얇은 두개골 제제를 사용하여 두 개의 광자를 이미징하는 절차를 보여드리겠습니다.

우리는 이 절차를 사용하여 만성 신경 염증을 연구합니다. 여기에 표시된 실험에서 시작하겠습니다. 미세아교세포를 포함하는 단핵 세포 계통에서 OT 발현 GFP가 사용됩니다.

특정 프로젝트의 요구 사항을 충족하기 위해 다양한 종류의 마우스를 사용할 수 있습니다. 수술을 위해 펜타닐, 미다졸람 마취 마우스를 준비하기 시작합니다. 먼저, 동물이 꼬리 꼬집기와 같은 고통스러운 자극에 더 이상 반응하지 않는지 확인하십시오.

마취 후 저체온증을 방지하기 위해 동물을 가열 패드에 올려 놓습니다. 그런 다음 눈을 촉촉하게 유지하기 위해 보호용 안과 연고로 동물의 눈을 덮습니다. 모든 수술 기구는 오토클레이브 또는 유리 구슬 살균기로 멸균되어야 하며, 70% 에탄올에 담그어 기구를 추가로 소독해야 합니다.

가위를 사용하여 동물의 두피에서 털을 제거한 다음 10% 포비돈 요오드 용액과 70% 에탄올을 사용하여 해당 부위를 소독합니다. 작은 가위를 사용하여 두피의 정중선을 절개하여 두개골에 닿은 4-5mm부터 눈 앞쪽으로 전진하여 수술을 시작합니다. 이 절개는 두 개의 광자 이미징 중에 마우스 머리를 안정화하는 플레이트의 접착을 피부가 방해하지 않을 만큼 충분히 길어야 합니다.

다음으로, 멸균 면봉에 100% 에탄올을 바르고 두개골 상단의 막을 건조시킵니다. 가는 핀셋을 사용하여 긁어냅니다. 멤브레인을 제거하지 않으면 헤드 플레이트 부착이 불안정해집니다.

해부 범위에서 얇게 할 영역을 식별합니다. 두개골 봉합사 바로 위에 위치한 관심 영역은 두개골이 덜 안정적이며 아래에 있는 큰 혈관과 수막이 관심 영역의 관찰 창으로 전송되는 이미징을 방해할 수 있으므로 피하십시오. 그런 다음 다시 면봉을 사용하여 10% 염화철 용액을 사용하여 두개골을 다시 시도하십시오.

퍼마 본드의 얇은 층을 배치하고, 헤드 플레이트 아래의 보기 창 가장자리 주위에 9개의 10 접착제를 놓습니다. 그런 다음 동물의 두개골에서 관심 영역 위에 가벼운 압력으로 플레이트를 놓고 접착제를 접착합니다. 주사기를 사용하여 보기 창의 가장자리 주위에 소량의 아크릴을 바릅니다.

마지막으로 보기 창의 가장자리에 소량의 Tite 4 54를 적용합니다. 누출을 방지합니다. 헤드 플레이트를 동물 홀더에 나사로 고정하고 해부 현미경으로 안정성을 확인하십시오 한 쌍의 집게로 가볍게 탐색하여 헤드 플레이트에 대한 두개골의 움직임이 없어야 합니다.

식염수 한 방울을 떨어뜨리십시오 view희석을 준비하기 위해 누출이 없는지 확인하기 위해 창을 엽니다. 멸균 면봉과 압축 공기를 사용하여 두개골을 건조시킵니다. IRF 0 0 7 드릴 비트를 사용하여 마이크로 드릴에서 두 개의 드릴로 두개골을 얇게 만듭니다.

4, 000 RPM에서. 지름 2-2.5mm의 원형 영역을 아주 부드럽게 얇게 만들기 시작합니다. 두개골과 거의 평행한 가벼운 스윕 동작만 사용하십시오.

직접적인 아래쪽 압력을 사용하지 마십시오. 압축 공기를 사용하여 뼈 가루를 제거하기 위해 20-30초마다 드릴링을 중지하십시오. 이러한 드릴링 중단은 두개골을 냉각시켜 아래에 있는 뇌 조직에 열로 인한 손상이 없도록 합니다.

드릴링이 진행됨에 따라 Diplo라고 하는 더 촉촉한 가시 뼈 층으로의 전환에 주목하십시오. 이 레이어에 도달하면 드릴에 각별한 주의를 기울이십시오. 때때로 얇은 부위에 식염수를 놓고 해부 범위 아래를 관찰하여 두개골의 두께를 확인합니다.

식염수는 열 발산을 더욱 가능하게 합니다. 두개골이 얇아지면 더 작은 혈관 구조가 보입니다. 치과용 마이크로블레이드를 사용하여 식염수 아래에서 최종 희석을 달성합니다.

마이크로블레이드는 두개골의 안정성에 대해 훨씬 더 촉각적인 피드백을 제공합니다. 따라서 드릴만 사용하는 것보다 훨씬 더 얇은 준비를 할 수 있습니다. 이미징을 위한 최적의 두개골 두께는 10-30마이크로미터입니다.

전체 솎아내기 과정은 일반적으로 15분에서 30분 정도 걸립니다. 얇은 두개골 창을 만들면서 epi 형광 아래에서 두개골의 얇음을 여러 번 확인합니다. 눈에 보이는 미세아교세포와 혈관 구조의 선명도와 깊이는 창이 이미징을 위해 준비되었을 때를 잘 나타냅니다.

창이 준비되면 1mm 직경의 유리 피펫을 사용하여 얇은 두개골 부분에 Cy 아크릴 접착제를 한 방울 떨어뜨리고 커버 유리 조각을 조심스럽게 그 위에 내립니다. 그런 다음 두개골을 부드럽게 눌러 과도한 접착제를 짜내고 두개골과 커버 유리 사이에 기포가 형성되어 시야를 방해하지 않도록 합니다. 건조되면 마이크로 블레이드를 사용하여 커버 유리 위에 남아 있는 접착제를 조심스럽게 제거하여 두 개의 광자 이미징을 준비합니다.

얇은 두개골 피질 창을 식염수로 덮고 epi 형광 아래에서 관심 영역을 찾습니다. 해당 영역의 후속 이미징을 가능하게 하려면 이미징용 사진 카메라를 사용하여 사진을 촬영합니다. 여기에 표시된 것은 920 나노 미터로 조정 된 ti 사파이어 레이저가 장착 된 맞춤형 2 개의 광 현미경이 사용됩니다.

형광은 전장 검출 모드에서 광전자 증배관 또는 PMT와 5 81 80 방출 필터를 사용하여 검출됩니다. 이미징 세션 전반에 걸쳐 20 x 수침 렌즈가 사용됩니다. 대물렌즈의 레이저 출력의 최대 출력을 50밀리와트에서 65밀리와트 사이로 설정합니다.

다음으로, 껍질 표면에서 최대 150마이크로미터 아래에 있는 피질층 1층 또는 2층의 관심 영역을 선택합니다. 재이미징을 용이하게 하려면 2배 줌에서 1배, 디지털 줌 3개로 동일한 시야의 사진을 촬영할 수 있습니다. 혈관은 후속 이미징 세션 동안 동일한 시야를 쉽게 찾을 수 있는 랜드마크 역할을 할 수 있습니다.

3x의 확대/축소에서 각각 80-90 Z 단계와 최대 30분 동안 5분마다 0.69마이크로미터 단계를 가진 여러 Zack을 획득합니다. 이를 통해 Zacks 인수 사이에 시간이 지남에 따라 미세아교세포의 형태와 거동을 잘 샘플링할 수 있으며, 식염수 수준과 마취 깊이를 확인할 수 있습니다. 필요한 경우, 주사 전 주사기 및 바늘에 문신이 침착되는 것을 방지하기 위해 시술 중에 마취 칵테일의 원래 용량의 1/3을 추가 용량으로 투여할 수 있습니다.

35 게이지 바늘과 10 마이크로 볼륨 주사기의 내부 라이닝을 바늘과 주사기를 모두 채울 때까지 사이징 용액을 회수하여 사일로화했습니다. 용액을 실온에서 5분 동안 그대로 둔 다음 주사기에서 용액을 비우고 플런저를 제거한 다음 주사기와 바늘이 완전히 건조되도록 합니다. 마지막으로 주사기와 바늘을 탈이온수로 철저히 씻습니다.

일단 사일로화되면 주사기와 바늘을 6개월 이상 사용할 수 있으며, 그 이후에는 재코딩이 필요합니다. 주입 당일, TAT 용액을 사일로화된 유리 슬라이드에 한 방울 떨어뜨립니다. 실리콘화된 피펫 팁을 사용하여 이 방울에서 마이크로 부피 주사기에 원하는 양의 용액을 로드합니다.

드릴 비트를 사용하여 직경 0.5mm의 작은 개두술을 수행하며, 3mm 상부 또는 두 개의 광자 이미지를 얻은 얇은 두개골 피질 창의 측면으로 수행합니다. 이렇게 하려면 두개골을 조심스럽게 얇게 만듭니다. 그런 다음 날카로운 집게를 사용하여 얇은 뼈층을 제거합니다.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 35게이지 크기의 바늘과 주사기를 개두술과 정렬합니다. 그런 다음 바늘을 껍질 표면 아래 700-900마이크로미터 깊이로 조심스럽게 전진시킵니다. 마이크로프로세서 제어 주사기 펌프를 사용하여 분당 80나노리터의 속도로 3마이크로리터를 공급합니다.

이 그림은 얇은 두개골 피질 창의 이식 후에 2개의 광자 영상으로 가시화된 GFP 표지한 microglia, 대략 50 micrometer, 껍질 표면의 밑에 보여줍니다. 얇은 두개골 피질 창을 이식한 후 15분에서 30분 후인 0일차에 촬영한 단일 두 광자 절편과 7일 및 17일 후에 촬영한 것은 선동적인 모욕이 없을 때 미세아교세포가 활성화된 상태로 유지되는 동안 창이 깨끗하게 유지되는 것을 보여줍니다. 이는 면역 효과기 세포와 다른 신경 세포 유형 사이의 정상 및 염증 상호 작용을 조사하기 위한 이 방법의 유용성을 강조합니다.

생체 내에서 HIV 신경독 TAT의 주입 후 6시간 및 24시간에 촬영한 Z 투영은 활성화된 미세아교세포의 현저한 형태학적 변화를 나타냅니다. 또한 신경염증의 급성 및 만성 모델에서 미세아교세포의 형태학적 변화를 실시간으로 연구할 수 있는 능력을 입증했습니다. 우리는 방금 얇은 두개골 창을 준비하고 이 절차를 수행할 때 신경 염증을 연구하는 데 사용하는 방법을 보여주었습니다.

두개골을 돌볼 때 제제 자체로 인한 손상을 방지하기 위해 시간을 할애하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.