Un test de bioluminescence calcium pour l'analyse fonctionnelle des moustiques ( Aedes aegypti) Et cochez ( microplus) G récepteurs couplés aux protéines

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser les relations structure-activité des neuropeptides d’arthropodes synthétisés sur leur RCPG apparenté. Ceci est réalisé par la transfection de l’ovaire du hamster chinois, K une cellules vides avec le vecteur d’expression G PCR R souhaité pour obtenir des lignées cellulaires transformées de manière stable dérivées d’une seule cellule dans un deuxième temps, la lignée cellulaire stable est transfectée avec le plasmide quaran, qui porte le rapporteur Gina Quaran pour mesurer la bioluminescence intracellulaire dans le test de plaque de bioluminescence calcique. Ensuite, le test de la plaque de bioluminescence calcique est effectué afin de déterminer les niveaux de calcium cytoplasmique lors de l’application d’un ligand peptidique à ces cellules recombinantes.

On obtient des résultats qui montrent des différences dans les unités de bioluminescence lors de l’application de peptides structurellement différents ou de différentes concentrations peptidiques sur les cellules recombinantes sur la base de la libération intracellulaire de calcium provoquée telle que détectée par le rapporteur d’une corrine dans le test sur plaque. Le principal avantage de l’utilisation de lignées cellulaires clonales transformées de manière stable exprimant des RCPG recombinants au fil des tendances et des protocoles d’expression est que les niveaux d’expression des récepteurs sont plus uniformes, ce qui permet d’obtenir des résultats cohérents. De plus, le ciblage de la protéine d’aquarium sur les mitochondries permet des mesures sensibles du calcium par bioluminescence démontrant l’expérience Aujourd’hui, il y aura deux étudiants diplômés en place, et Simon Kersch ainsi qu’un postdoc de mon laboratoire.

Pour établir des lignées cellulaires stables, commencez par cultiver des ovaires de hamster chinois, K et des cellules vides à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone. Maintenez les cellules vides dans le milieu de croissance avec un antimycosique antibiotique une fois que les cellules se développent sainement. Voir l’ovaire du hamster chinois K une cellule dans des flacons de culture de tissus T 25 faire pousser les cellules pendant la nuit dans un milieu de croissance sans antibiotiques jusqu’à ce qu’elles soient à environ 30 % de confluence.

Avant la transfection. Préparer un vecteur d’expression d’ADN contenant le RCPG d’intérêt, tel que décrit dans le protocole écrit. Combinez l’ADN avec 100 microlitres de milieu sérique réduit Optum.

Mélangez six microlitres de réactif de lipofection dans 100 microlitres de F 12 K, milieu sans sérum et incubez à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Après l’incubation, mélangez doucement l’ADN et les solutions d’expectative pour les lèvres de manière goutte à goutte. Laissez reposer le mélange à température ambiante pendant 10 à 15 minutes dans un tube de 15 millilitres.

Mélangez délicatement le mélange de transfection dans 1,8 millilitres de F 12 K moyen frais en goutte à goutte. Ensuite, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez cette nouvelle solution de transfection aux cellules. Après une incubation de 18 heures.

Changer le milieu à F 12 K, milieu plus 10 % FBS sans antibiotiques et incuber toute la nuit le lendemain. Divisez les cellules en deux fioles T 25 avec F 12 K, milieu plus 10 % FBS sans antibiotiques comme décrit dans la procédure écrite. Incuber pendant 18 heures supplémentaires.

Remplacez le milieu par un milieu sélectif. Ensuite, cultivez les cellules à l’aide du milieu sélectif pendant trois à quatre semaines au fil du temps. Cela sélectionnera les cellules qui ont incorporé de manière stable le plasmide dans leur ADN génomique.

Continuez à entretenir les cellules à l’aide d’un milieu d’entretien, congelez périodiquement les lignées cellulaires pour éviter la perte en cas de contamination inattendue. Pour sélectionner les lignées cellulaires clonales, essayez d’abord de trypsine oculaire et centrifugez les cellules avec un milieu d’entretien comme décrit dans le protocole écrit. Puis Resus, suspendez les cellules dans cinq millilitres de milieu d’entretien.

Retirez 0,5 millilitre de suspension cellulaire et ajoutez 4,5 millilitres de milieu d’entretien frais pour faire une dilution de 10 x et transférez 100 microlitres de la dilution de 10 x dans 12 puits d’une plaque de 96 puits pour sélectionner des cellules simples. Continuez à faire une dilution en série de 10 fois de ces cellules environ 19 fois pour une suspension finale théorique d’une cellule par 100 microlitres et transférez 100 microlitres de chaque dilution en série dans 12 puits d’une plaque de 96 puits. Après 18 heures d’incubation, observez des plaques à 96 puits sous un microscope à lumière inversée ou à fluorescence et des puits de Mark qui semblent ne contenir qu’une seule cellule ou deux cellules qui se sont manifestement séparées d’une seule cellule.

Observez les plaques tous les jours, en changeant de milieu tous les trois jours. Laissez les cellules se développer pendant une semaine jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 80 %. Rincez ensuite les puits marqués avec 200 microlitres de PBS et de trypsine.

Les yeux avec 100 microlitres de PBS tripsin solution EDTA. Retirez le PBS TRIPSdans la solution EDTA. Ajoutez 100 microlitres de milieu d’entretien et transférez les cellules de chaque puits marqué dans un puits d’une plaque à six puits avec un millilitre de milieu d’entretien.

Après avoir cultivé les cellules dans la plaque à six puits pendant trois jours, transférez les cellules dans des flacons T 25 individuels. Congelez périodiquement la lignée cellulaire afin qu’elle puisse être récupérée si les cellules cessent de fonctionner de manière constante. Pour déterminer la lignée cellulaire avec la réponse la plus élevée, testez les cellules transférées à l’aide du test de bioluminescence calcique avec un ligand actif tel que le récepteur, le peptide, le ligand ou un autre agoniste de contrôle positif.

Le test de bioluminescence calcique sera démontré en détail plus loin dans cette vidéo. Effectuez la sélection d’une seule cellule une deuxième fois avant de poursuivre l’expérience. Lorsque des lignées cellulaires clonales sont choisies pour des tests et maintenues en culture, il est essentiel de garder une trace des numéros de passage, car les cellules à nombre élevé de passages peuvent cesser de fonctionner dans un flacon T 25.

Lignées cellulaires brutes exprimant le récepteur souhaité dans le milieu d’entretien à environ 90 % de confluence. Après l’essai et la centrifugation des cellules ressus, suspendez-les dans le milieu d’entretien, diluez les cellules environ 10 fois avec du milieu d’entretien et comptez le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Ensuite, ajustez le nombre de cellules à environ deux fois 10 à la cinquième cellules par millilitre, ensemencez deux millilitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à six puits et incubez la plaque pendant 24 heures, après quoi la cellule devrait être confluente à environ 60 % avant le début de l’essai de bioluminescence calcique.

Préparez le gène rapporteur d’intérêt dans la construction du vecteur d’expression. Une mitochondrie exprimée un rapport de quorum est utilisé ici. Ensuite, transfectez les cellules avec un microgramme de ce plasmide rapporteur comme décrit dans le protocole écrit.

Après avoir incubé les cellules dans une plaque à six puits pendant 24 heures, la trypsine, la centrifugeuse et la remise en suspension, les cellules comptent le nombre de cellules jusqu’à 400 000 cellules par millilitre et transfèrent 100 microlitres dans chaque puits d’une plaque de micro-titrage à fond mince et blanc de 96 puits, incubent pendant encore 24 heures jusqu’à ce qu’environ 80 % de confluence soit atteinte. Il s’agit de la concentration optimale de cellules pour le test de bioluminescence. Les étapes suivantes doivent être effectuées dans l’obscurité, mais sont illustrées ici à la lumière.

À des fins de démonstration, préparez suffisamment de milieu DME sans calcium contenant cinq micromolaires de CHO terezin pour 90 microlitres par soudure. Retirez l’ancien support de la plaque et ajoutez 90 microlitres dans chacune. Eh bien, incubez les plaques pendant trois heures dans l’obscurité à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, après quoi les cellules sont prêtes à être testées.

Cette démonstration est réalisée à l’aide d’un lecteur de plaques étoiles Nova en mode bioluminescence. Pour commencer la purge, la machine pompe la plaque doit être placée dans le support de plaque dans l’obscurité. Solubiliser les peptides dans un tube EOR de 1,5 millilitre.

Utilisation d’une quantité suffisante de DME sans calcium et d’un milieu pour 10 microlitres de 10 x peptide par puits. Réglez la détermination de la profondeur d’aspiration et de la position de la solution peptidique avant utilisation. Défiez les cellules avec 10 microlitres de peptide et commencez immédiatement à enregistrer l’émission de lumière.

Dans cette démonstration, l’instrument est configuré pour enregistrer l’émission de lumière à 465 nanomètres pour chaque puits toutes les deux secondes pendant une durée totale de 50 secondes. Une fois le cycle terminé, lavez les pompes de la machine. Répétez le processus pour chaque échantillon de peptide, enregistrez les données et lavez à nouveau les pompes de la machine après le dosage.

Les données d’émission de lumière de chaque puits sont automatiquement transférées dans une feuille de données Microsoft Excel par le logiciel. Collez les données d’Excel dans Prism Software 4.0. Générez un graphique avec les différentes concentrations de peptides dans l’axe des x et les unités de bioluminescence.

Dans l’axe Y, sélectionnez une analyse d’ajustement de courbe de régression non linéaire pour obtenir des courbes de réponse de concentration pour chaque peptide dans leurs valeurs EC 50 correspondantes. Chaque expérience doit être répétée trois fois pour l’analyse des données. Lorsqu’il est exprimé dans l’ovaire du hamster chinois, les cellules K one, le récepteur kinine de l’aegypti de la publicité du moustique se sont comportés comme un récepteur multi-ligand et ont répondu fonctionnellement à aussi bas qu’un animo.

Pour les trois kinines endogènes des années 80 testées individuellement à l’aide du test sur plaque de bioluminescence calcique. Statistiquement différentes, des valeurs EC 50 d’environ 16 nanomolaires pour l’aegypti kinine 3 des années quatre-vingt, de 26 nanomolaires pour l’aegypti kinine deux et de 49 nanomolaires pour l’aegypti kinine un des années quatre-vingts ont été déterminées, ce qui a permis d’obtenir un ordre de puissance de la kinine des années 80 comme la plus puissante et de la kinine 1 des années 80 comme la moins montrée. Voici la comparaison de l’activité de six analogues de kinine de l’acide butyrique alpha amino ISO sur le récepteur de la tique kinine exprimant l’ovaire K d’un hamster chinois une lignée cellulaire par un test de bioluminescence calcique.

L’axe des Y représente le pourcentage d’unités de bioluminescence maximales pour chaque analogue, exprimé en pourcentage de bioluminescence observée à une concentration par rapport à la réponse maximale observée à toutes les concentrations testées pour chaque analogue analogique PEPTIDE KININE HEXA F-F-F-S-W-G amide est le témoin positif de l’activité du récepteur. L’amide WG de l’acide butyrique double F amino ISO de remplacement unique était plus actif que l’analogue du peptide KININE KININE de contrôle positif, l’analogue de KININE avec deux substituts d’acide aminobutyrique, l’amide de l’acide aminobutyrique FF était le plus puissant des analogues de remplacement double testés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer A-G-P-C-R et d’obtenir des lignées cellulaires clonales pour analyser les relations d’activité structurées des ligands sur les récepteurs par un test de bioluminescence calcique.