Formação de Epithelium próstata humano utilizando Tissue Recombinação de Rodent Urogenital Mesênquima Sinus e células-tronco humanas
22 de junho de 2013
Para desvendar são desesperadamente necessários os primeiros mecanismos moleculares subjacentes câncer de próstata iniciação, romance e sistemas de modelos humanos e abordagens inovadoras. O potencial de pré-prostática seio urogenital mesênquima (UGSM) para induzir as populações de células estaminais pluripotentes para formar o epitélio da próstata humana é uma ferramenta poderosa na investigação experimental próstata.
O objetivo geral deste procedimento é isolar o mesênquima do seio urogenital, ou UGSM, de embriões de roedores e implantar misturas de tecido na cápsula renal que possam formar epitélio prostático humano. Isso é realizado primeiramente isolando o seio urogenital de embriões de camundongo ou rato. Em seguida, o mesênquima do seio urogenital é separado do epitélio.
Em seguida, suspensões de células isoladas do mesênquima do seio urogenital são combinadas com células-tronco pluripotentes. Por fim, a mistura celular é implantada sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a formação de epitélio prostático humano no rim do camundongo mediante a validação da expressão específica de PSA humano.
Embora este método possa fornecer informações sobre a função prostática e o início de doenças, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como xenotransplantes de tumores prostáticos humanos e indução de linhagens celulares tumorogênicas semanais para formação de tumores. Após eutanasiar um camundongo ou rato prenhe com tempo controlado e isolar os embriões, separe-os da bolsa amniótica, corte o cordão umbilical e transfira-os para um tubo de 50 mililitros contendo solução salina equilibrada de Hanks gelada, mantendo-o sob gelo.
Coloque um embrião em uma placa de Petri de 100 milímetros e use uma tesoura para dividi-lo ao meio ao nível do bolo. Remova o estômago e o intestino delgado e, em seguida, localize os ovários no embrião feminino, que são encontrados nos polos caudais dos rins, ou os testículos no embrião masculino, localizados ao nível da bexiga. Sob um microscópio de dissecação.
Use tesoura de Veneza para cortar a parede abdominal e expor a bexiga e a parede posterior do abdômen. Solte o trato genital superior dos pontos de fixação e libere o cordão umbilical. Corte o osso púbico com pinça fina de ponta Dumont.
De forma romba, separe-a da parede anterior do seio urogenital. Separe a parede posterior do seio urogenital do reto e corte o seio urogenital com a bexiga na extremidade inferior. Em seguida, separe a bexiga do seio urogenital.
Armazene o seio urogenital e o fragmento em HBSS gelado. Transfira o seio urogenital para um tubo de 50 mililitros contendo 1% de tripsina em HBSS sem cálcio e magnésio e incube a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, remova a tripsina e adicione meio DMEM/F12 com 10% de FBS para neutralizar a digestão.
Em seguida, utilize uma agulha ou pinças de ponta fina para cuidadosamente separar a bainha mesenquimal aderente do tubo epitelial. Manter o tubo epitelial intacto reduz as chances de contaminação das células epiteliais no mesênquima. Isso pode resultar na formação de glândulas de roedores juntamente com o epélio glandular humano derivado de células-tronco.
Transfira o UGSM para um novo tubo de 50 mililitros contendo meio DMM F12 com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos não essenciais e um nanomolar de R 1 8 81. Incube o tubo a 37 graus Celsius com 5% de CO2 durante a noite. No dia seguinte, centrifugue o tecido a 200 ×g. Descarte o sobrenadante e use PBS para lavar o pellet.
Após remover o PBS, re-suspenda o tecido em 0,2% de colagenase em D-M-A-M-F 12 e incube a 37 graus Celsius com agitação suave por uma hora. Vortexe vigorosamente o tecido digerido três vezes até que se torne uma mistura homogênea de células isoladas e neutralize a colagenase adicionando meio D-M-A-M-F 12 com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos não essenciais e um nanomolar de R 1 8 81. Lave as células três vezes centrifugando-as a 200 G e re-suspendendo-as em HBSS. Por fim, re-suspenda as células mesenquimais em DMM F 12 e utilize um hemocitômetro para contá-las antes de realizar o transplante.
Após preparar uma área cirúrgica estéril e anestesiar um camundongo nu atímico macho com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina, de acordo com o protocolo descrito, realize uma compressão no dedo do pé para confirmar o nível de sedação; prepare cirurgicamente o camundongo, depilando o local cirúrgico se necessário e limpando-o com três passadas alternadas de álcool a 70%, seguidas por solução de Betadine. Após aplicar pomada oftálmica, faça uma incisão longitudinal de um centímetro nas costas e continue cortando a parede abdominal com uma incisão longitudinal de 0,5 centímetro. Com cuidado, pressione o rim para fora do abdômen e utilize gotas de solução salina estéril para mantê-lo úmido.
Em seguida, utilizando uma agulha de seringa de 27 graus, perfure suavemente a cápsula renal para criar um local de injeção para a mistura celular. Depois, preencha uma agulha de seringa de 28 graus com 10 microlitros da mistura celular e insira-a lentamente no local da punção, penetrando o parênquima renal, a fim de atingir uma área sob a cápsula renal.
Injete 10 microlitros da mistura celular para formar um bolo sobre o rim abaixo da cápsula renal e retire a agulha. Retorne o rim à cavidade abdominal e fixe a camada muscular do peritônio com pontos de náilon 4-0. Feche a pele com pontos ou grampos e use solução salina estéril para limpar qualquer sangue da pele.
É mostrada aqui uma imagem de ultrassom de um xenoenxerto em crescimento oito semanas após a implantação. A área circulada representa o xenoenxerto na superfície do rim. Essas imagens demonstram o crescimento do xenoenxerto na superfície do rim.
Após 12 semanas, células-tronco embrionárias humanas implantadas na ausência de mesênquima do seio urogenital formarão grandes teratomas, enquanto o mesênquima do seio urogenital implantado isoladamente não formará nenhuma estrutura discernível. Mostrado no centro. Os painéis desta figura são colorações imuno-histoquímicas representativas de epitélio prostático humano derivado de células-tronco em comparação com tecido prostático humano adulto.
Como mostrado aqui à esquerda, as glândulas contêm uma camada epitelial luminal positiva para AR. Essa camada também é positiva para PSA, uma camada de células epiteliais basais positivas para P 63 e cromogranina rara. Células neuroendócrinas, as glândulas não são cancerígenas, conforme demonstrado pela coloração negativa para A-M-A-C-R após a castração do hospedeiro.
As células luminas positivas para PSA e AR não estão mais presentes, demonstrando a característica dependência androgênica. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter muito cuidado ao separar o mesênquima do seio urogenital do epitélio. Uma vez que o epitélio do seio urogenital contaminante formará glândulas e potencialmente poderá confundir seus resultados.
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Visão Geral
Este estudo tem como foco o isolamento do mesênquima do seio urogenital de roedores (UGSM) para investigar seu potencial na formação do epitélio prostático humano. Ao combinar o UGSM com células-tronco pluripotentes e implantar a mistura na cápsula renal de um camundongo hospedeiro, os pesquisadores pretendem compreender os mecanismos de iniciação do câncer de próstata.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa sobre câncer de próstata
- Biologia de células-tronco
- Medicina regenerativa
Antecedentes
- O câncer de próstata é um problema de saúde significativo.
- Compreender os mecanismos moleculares iniciais é crucial para a prevenção.
- Sistemas de modelos humanos são necessários para uma pesquisa eficaz.
- O MTSU tem potencial na formação do epitélio prostático.
Objetivo do Estudo
- Isolar UGSM de embriões de roedores.
- Explorar a capacidade do UGSM de induzir o epitélio prostático humano.
- Desenvolver um modelo para estudar o início do câncer de próstata.
Métodos Utilizados
- Isolamento do seio urogenital de embriões de roedores.
- Separacão do MSU do epitélio.
- Combinação do MSU com células-tronco pluripotentes.
- Implante da mistura celular sob a cápsula renal de um camundongo hospedeiro.
Resultados Principais
- Formação bem-sucedida de epitélio prostático humano no rim de camundongo.
- Validação por meio da expressão específica de PSA humano.
- Demonstração do potencial do MGSU na pesquisa da próstata.
- Conhecimentos sobre os mecanismos moleculares do início do câncer de próstata.
Conclusões
- O UGSM pode efetivamente induzir a formação do epitélio prostático humano.
- Este modelo fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa sobre câncer de próstata.
- São necessários estudos adicionais para explorar os mecanismos subjacentes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método atende à necessidade crítica de sistemas modelo derivados de humanos e livres de hormônios na pesquisa do câncer de próstata, permitindo a desmistificação mecanicista de fatores de suscetibilidade genética. Ao utilizar o mesênquima do seio urogenital de roedores para induzir epitélio prostático humano a partir de células-tronco, ele fornece uma plataforma preditiva para validação de alvos e investigação de vias. A abordagem apoia fluxos de trabalho de descoberta precoce ao acelerar testes funcionais de genes candidatos à carcinogênese antes da identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da análise das consequências funcionais de genes candidatos de suscetibilidade ao câncer de próstata em um contexto epitelial humano.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da formação dependente de testosterona do epitélio prostático humano normal, esclarecendo as dependências da sinalização do receptor de andrógeno.
- Valor Preditivo: Acelera a avaliação de combinações gênicas consideradas promotoras ou inibidoras da carcinogênese em comparação com modelos transgênicos tradicionais em roedores.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaios: Gera estruturas epiteliais prostáticas humanas validadas, adequadas para triagem de compostos e análise de biomarcadores.
- Saída quantitativa: Permite a medição da expressão específica de PSA humano como parâmetro funcional para diferenciação epitelial e resposta ao andrógeno.
- Reprodutibilidade: O isolamento padronizado de UGSM e o implante na cápsula renal favorecem a consistência entre laboratórios na geração do modelo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Forma epitélio prostático humano independente de hormônios que recapitula as linhagens basais e luminas, permitindo o estudo de eventos iniciais da carcinogênese.
- Continuidade Translacional: Fornece uma ponte entre a manipulação genética de células-tronco e os desfechos fenotípicos em nível tecidual em um hospedeiro imunocomprometido.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite a avaliação de modificações genéticas sob condições controladas dependentes de andrógenos antes de se comprometer com programas pré-clínicos onerosos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra à descoberta inicial ao permitir testes de hipóteses sobre fatores genéticos em um sistema epitelial relevante para humanos, apoiando decisões de prosseguir ou não antes do desenvolvimento de ensaios e dos esforços de identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Facilita a elucidação de vias e a redução de riscos mecanicistas ao isolar variáveis, como as interações estroma-epiteliais na formação do tecido prostático.
- Triagem: Produz estruturas epiteliais padronizadas que podem ser utilizadas para avaliar os efeitos de compostos sobre diferenciação e resposta hormonal.
- Análises: Gera biomarcadores específicos humanos quantificáveis (por exemplo, PSA) e leituras imuno-histoquímicas para validação de linhagem.
- Pesquisa Translacional: Permite a continuidade do estudo desde a perturbação genética até os resultados histológicos em um sistema relevante para a doença.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para testar múltiplos alvos genéticos ou combinações em um modelo consistente de epitélio prostático humano.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista em modelos de carcinogênese prostática por meio da indução estromal definida.
- Valor Operacional: Promove a reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de isolamento do UGSM e implante na cápsula renal.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a rápida iteração de hipóteses genéticas em um sistema baseado em células humanas.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de alvos com base na validação funcional em um contexto epitelial com resposta hormonal.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em dissecação de roedores embriões e separação de tecidos para obter populações puras de MGSU.
- Depende de modelos hospedeiros imunocomprometidos para implantação sob a cápsula renal e sobrevivência do xenoenxerto.
- Necessita de infraestrutura cirúrgica estéril e cuidados pós-operatórios para a sobrevivência do animal hospedeiro.
- Envolve processamento de tecidos em múltiplos dias, incluindo etapas de dissociação enzimática e cultivo para gerar suspensões de células isoladas.
- Limitado pela dependência atual em xenotransplantes in vivo, com potencial futuro para formação de glândulas in vitro ou uso de iPSCs.
