Análisis de la apoptosis en embriones de pez cebra en Todo el montaje de inmunofluorescencia para detectar la caspasa 3 activada

El objetivo general de este procedimiento es analizar embriones enteros de pez cebra entre la etapa de cuatro células y 32 horas después de la fertilización para detectar la presencia y ubicación de células apoptóticas. Esto se logra primero recubriendo los embriones en un punto de tiempo deseado. A continuación, los embriones son fijos y permeables.

A continuación, los embriones se incuban con el anticuerpo 3 anticaspasa 3 de conejo, seguido de un anticuerpo secundario anti conejo marcado con fluorescencia para marcar con fluorescencia las células apoptóticas. Finalmente, los embriones se analizan mediante microscopía de fluorescencia. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran diferencias en el número y la ubicación de las células apoptóticas entre los embriones control y los embriones tratados o mutantes mediante inmunofluorescencia.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis de células apoptóticas mediante tinción de naranja de Aine o el ensayo de túnel, es que el ensayo de tres caspasas es un método altamente reproducible y relativamente barato para experimentos en los que se requiere documentación fotográfica y/o cuantificación de células apoptóticas en múltiples muestras. Quienes demostrarán el procedimiento estarán Shelly SOLs, una estudiante graduada de mi laboratorio y Christian Tono, un técnico de mi laboratorio bajo una campana de gases químicos. Prepare 50 mililitros de formaldehído al 4% o PFA agregando polvo de PFA, el que XPBS protege de la luz y revuelva a 60 grados Celsius durante una hora para disolver, almacene a cuatro grados Celsius durante un mes o a menos 20 grados Celsius durante dos años.

Prepare 100 mililitros de metilcelulosa al 4% calentando 30 mililitros de agua a 80 grados centígrados. Luego agregue cuatro gramos de metilcelulosa y revuelva para disolver a temperatura ambiente. De cuatro horas a toda la noche.

Lleve el volumen a 100 mililitros y mezcle a cuatro grados centígrados durante una hora. Almacene a temperatura ambiente, recoja los embriones inmediatamente después de la fertilización y déjelos desarrollar hasta el punto de tiempo deseado entre la etapa de cuatro células y 32 horas después de la fertilización o HPF cuatro embriones entre la etapa de yema de cola y 32 HPF. Eliminar el corion incubando los embriones en 100 microlitros de 10 miligramos por mililitro.

Pronase en 10 mililitros de uno x agua de huevo durante 30 minutos. A temperatura ambiente. Vierta la solución de pronasa lentamente.

Agregue una x agua de huevo y repita el enjuague dos veces más. Luego, transfiera hasta 40 embriones a un tubo de 1.5 mililitros y use un mililitro de un X-P-B-S-T para enjuagar dos veces después de eliminar todos menos unos 100 microlitros del PBT. Agregue un mililitro de 4% de PFA.

Coloque las trompas de lado en un recipiente de tamaño adecuado para facilitar su transporte y colóquelas en una mecedora suave a cuatro grados centígrados durante la noche o hasta una semana después de fijar los embriones. Retire la mayor parte de la solución de PFA y, con cuidado, agregue un mililitro de metanol 100% helado. Coloque los tubos de lado y colóquelos a menos 20 grados centígrados durante dos horas.

Alternativamente, los embriones pueden dejarse a menos 20 grados centígrados durante un máximo de 24 horas. Después de la incubación, deje que los embriones se asienten en el fondo del tubo antes de eliminar la mayor parte del metanol y agregar cuidadosamente un mililitro de un XPBS con 0,3% de trite x y 1% de DMSO. Retire inmediatamente el PDT y reemplácelo con un PDT nuevo.

Luego coloque los tubos de lado y mece durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar cuidadosamente la mayor parte de la PDT, agregue 500 microlitros de tampón de bloqueo y asegúrese de que el embrión permanezca emergido en solución. Meca suavemente durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, agregue un microlitro de anticuerpo de caspasa antiactivado de conejo tres y anticuerpos no rabiosos adicionales.

Si lo desea, meca suavemente los embriones durante dos horas a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Después de retirar la solución de anticuerpos, agregue un mililitro de PDT para enjuagar rápidamente los embriones. Luego reemplácelo con PDT fresco y meza suavemente durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Antes de repetir el lavado, retire el lavado PDT y repita el paso de bloqueo. A continuación, añada los anticuerpos secundarios conjugados Fluor 4 adecuados. Protéjase de la luz y meciérrese suavemente durante una hora a temperatura ambiente bajo un microscopio fluorescente con el filtro adecuado.

Analice los embriones en un XPDT. Si los controles positivos tienen una fluorescencia brillante con un fondo mínimo, transfiéralos a una placa de Petri de 3,5 centímetros con una capa delgada de 4% de metilcelulosa o a un portaobjetos de depresión con una gran gota de metilcelulosa usando una sonda en ángulo. Orientar un embrión de interés para la toma de imágenes, tomando imágenes que representen la fluorescencia, la intensidad y los patrones observados en la mayoría de los embriones de esa muestra.

Esta figura demuestra que la inyección de embriones con altas concentraciones de ARNm que codifica el potente proto BH 3 solamente. Proteínas como BIM o NOA dan lugar rápidamente a la caspasa activa tres. En la etapa de desarrollo de cuatro células, la muerte embrionaria ocurre posteriormente dentro de una hora.

En etapas posteriores del desarrollo, la intensidad de la fluorescencia es más robusta. Por ejemplo, aquí se muestran células positivas para caspasa activa brillante tres en embriones en etapa de esfera que han sido inyectados con niveles moderadamente tóxicos de ARNm que codifica solo el BH tres pro apoptótico. El gen mensajero de Puma, ARN, que codifica el gen BCL dos antia potto, se coinyectó para demostrar que la inyección de ARNm de Puma induce la apoptosis a través de la vía intrínseca mediada por mitocondrias.

La apoptosis inducida por IR y el pez cebra requiere la transcripción mediada por P 53 de BH tres genes únicos, como el puma. El retraso en la apoptosis inducida por IR que se muestra aquí es consistente con el requisito de transcripción mediada por P 53. El protocolo caspasa tres debería dar lugar a una relación señal/ruido robusta.

Esta figura compara el resultado óptimo del ensayo de caspasa tres con dos resultados subóptimos comunes que surgen cuando los pasos críticos se ven comprometidos, como se describe en la sección de discusión del protocolo de texto. La primera es una relación señal/ruido débil debido a la fluorescencia de fondo en el tejido animal, y la segunda es la fluorescencia de la yema que distrae de la señal de interés. Por último, como se muestra aquí, se realizaron experimentos de comarcaje utilizando líneas transgénicas que expresan GFP, tejidos aproximados en apoptosis, el transgénico OLE dos EGFP VU, etiquetas de 12 líneas, neuronas motoras y oligodendrocitos, y el transgénico elev L tres etiquetas de línea de EEG FP, todas ellas neuronas diferenciadoras.

Los resultados sugieren que tanto las neuronas como los oligodendrocitos son sensibles a la apoptosis inducida por IR después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la tinción de cos con anticuerpos primarios específicos de tejido y la succión de embriones, para determinar la identidad exacta de las células que experimentan apoptosis.