신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 신생아 뉴런 간외 담관세포를 분리하고 배양하는 것입니다. 이것은 먼저 외과적으로 복부 장기를 노출시켜 간과 담관에 접근할 수 있도록 함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 담관과 담낭을 둘러싼 결합 조직과 지방을 꼼꼼하게 제거하는 것입니다.

그런 다음 세척된 담관과 담낭을 두꺼운 콜라겐 젤에 놓고 3주 동안 배양합니다. 담관세포는 관에서 이동하여 추가 배양을 위해 얇은 콜라겐 젤로 분리됩니다. 궁극적으로 결과는 면역형광 현미경 검사를 통해 순수한 담관세포의 단층을 보여줍니다.

일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 일반적으로 해부 기술과 작은 담관 청소에 대한 기술적 어려움으로 인해 어려움을 겪습니다. 이 절차를 위해 조직 배양 후드와 인큐베이터 가까이에 마우스 수술대를 설치하십시오. 멸균된 모든 수술 도구를 70% 에탄올이 함유된 비커에 넣습니다.

60mm 접시에 3개의 미디어를 넣고 얼음 위에 놓습니다. 수술대에는 두 가지 접시가 필요하지만 다른 재료는 후드에 보관하십시오. 콜라겐은 얼음 위에 있어야 합니다.

안락사된 0일에서 3일 된 신생아 마우스를 해부 보드의 누운 자세로 놓는 것으로 시작합니다. 골반 근처의 정중선을 따라 작은 수평 절개부터 시작합니다. 절개 부위를 양쪽으로 뻗어 U자형 피판을 만들고 장기를 노출시킵니다.

이제 장을 복부 오른쪽으로 조심스럽게 옮깁니다. 간과 담관을 보려면 필요한 경우 피부 절개 부위를 확장하여 플랩을 확대합니다. 절개 범위에서 총담관을 주의 깊게 식별하고 청소합니다.

결합 조직과 주변 지방을 제거합니다. 다음으로 동일한 작업을 수행합니다. 담낭을 청소하려면 담관과 담낭을 제거하고 준비된 접시 중 하나에 넣으십시오.

더 많은 결합 조직을 제거하고 담즙을 배출하기 위해 등급이 지정되지 않은 집게를 사용하여 구조를 마사지하십시오. 그런 다음 깨끗한 티슈를 두 번째 접시에 옮깁니다. 정확히 5명의 신생아에서 조직을 채취할 때까지 이 절차를 계속 반복합니다.

두꺼운 콜라겐 젤을 준비하는 것으로 시작하십시오. 항상 이것을 먼저 새로 만드십시오. 모든 멸균 용액을 얼음 위에 함께 올려 놓습니다.

1 XPBS의 1밀리리터당 콜라겐 2mg에 필요한 부피를 계산합니다. 각 부분에 수산화나트륨 0.023부를 추가합니다. 콜라겐. Pipetting을 통해 실온에서 부분 표본을 함께 혼합합니다.

콜라겐을 첨가하기 전에 PBS 수산화나트륨과 증류수를 혼합하는 것이 필수적입니다. 콜라겐 스톡은 겔에 첨가된 마지막 성분이어야 하며 최종 용액을 피펫으로 삽입해야 합니다. 글쎄요, 이것은 콜라겐이 뭉치는 것을 방지합니다.

용액이 젤과 같은 일관성을 갖기 시작하면 즉시 분리된 조직을 삽입한 다음 포함된 조직을 30분 동안 인큐베이터로 옮겨 응고시킵니다. 응고되면 겔에 3.5ml의 BEC 배지를 오버레이하고 그 후 배양을 계속합니다. BEC 배지를 일주일에 세 번 교체하십시오 3주 이내에 내장된 관에서 뻗어 나온 큰 핵을 가진 세포 시트가 형성됩니다.

이들은 담관세포입니다. 접시에 섬유아세포의 개체수가 많은 경우 절단할 수 없는 한 접시를 버려야 합니다. 이제 100mm 플레이트에 PBS 코팅 1밀리리터당 콜라겐 1밀리그램이 함유된 얇은 콜라겐 젤을 준비하고 콜라겐을 골고루 펴고 10분 동안 기다립니다.

10분 후 DM EMF 12 7ml로 플레이트를 덮고 10분 동안 배양합니다. 짧은 배양 후 XPBS 1개로 콜라겐을 빠르게 세척합니다. 흡인에 의해 모든 PBS를 제거한 다음 첫 번째 층을 구축하기 위해 했던 것처럼 두 번째 콜라겐 층을 추가합니다.

응고되면 플레이트를 DMF 12로 오버레이하고 30분 동안 배양합니다. 이제 두꺼운 젤에서 세포를 분리하십시오. 먼저 주걱이나 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 콜라겐을 부드럽게 분리하여 뜨게 합니다.

다음으로, 여과된 콜라겐 분해 효소 용액을 준비하고 60mm 두께의 콜라겐 접시 각각에 1밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 30분 배양 후 세포가 포함된 모든 용액을 제거하고 15ml 튜브로 옮깁니다.

튜브를 아래로 돌리고 흡인으로 상층액을 제거합니다. 펠릿을 4.5ml의 DM F 12 매체에 재현탁시키고 다시 스핀다운합니다. 펠릿을 0.5% 트립신 3밀리리터에 재현탁시키고, 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 배양하며, 이 시간 동안 세포 시트가 느슨해집니다.

5분 후 5mm 또는 10ml 피펫을 통해 덩어리가 부서질 때까지 흐릅니다. 그런 다음 5ml의 BEC 배지를 추가하고 세포를 스핀다운합니다. 세 번째 소생.

세척 단계로 DMM F 12 매체에 펠릿을 현탁시키고 셀을 다시 펠릿화합니다. 이제 BEC 배지에 세포를 재현탁하고 준비된 얇은 층에 플레이트를 만듭니다. 콜라겐 겔은 세포를 성장시켜 필요에 따라 콜라겐 겔에서 세포를 분할합니다.

기술된 프로토콜을 사용하여, 순도가 우수한 신생아 마우스 간외 담관세포 집단을 분리하고 K 19 면역형광으로 염색하였다. 이 비디오를 시청한 후에는 두꺼운 콜라겐 겔에서 세심한 관 절개와 배양을 조합하여 순수한 신생아 마우스 간외 담관세포 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.