Os ensaios bioquímicos para analisar as actividades de ATP-dependente cromatina remodelação Enzimas

O objetivo do procedimento a seguir é medir as várias atividades bioquímicas de um complexo de remodelação da cromatina dependente de TP. Isso é obtido medindo um deslizamento dependente de TP de um nucleossomo de posição de uma extremidade de uma molécula de DNA para uma posição mais central no DNA usando um ensaio de mudança de mobilidade eletroforética ou emsa. Um método semelhante baseado em EMSA pode ser usado para monitorar a formação de zonas mononucleo ligadas a complexos de remodelação para avaliar a atividade de ligação de nucleossomos dos complexos de remodelação da cromatina.

Além disso, a cromatografia em camada delgada pode ser usada para medir a atividade de APAs de complexos de remodelação de cromatina dependentes de TP. Em última análise, esses métodos podem ser usados para medir a remodelação da cromatina dependente de TP de humanos em complexos O 80. Neste vídeo, demonstraremos ensaios bioquímicos estudando complexos de remodelação da cromatina NO 80.

Método semelhante também pode ser aplicado para estudar outros complexos de remodelação da cromatina, bem como para realizar o ensaio de remodelação de nucleossomos dependente de TP. Primeiro prepare os substratos nucleossômicos após configurar uma reação de PCR de 100 microlitros, conforme descrito na tabela. Execute as reações de PCR em um termociclador e, em seguida, passe os produtos da reação duas vezes através de colunas de spin livre de nuclease para remover quaisquer nucleotídeos não incorporados.

Em seguida, misture dois fragmentos de DNA marcados com P 32 6 0 1 com seis microgramas de nucleossomos hilares em 50 microlitros de tampão e incube a mistura a 30 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, dilua sequencialmente a mistura para cloreto de sódio 0,8 molar, 0,6 molar e 0,4 molar pela adição de 12,5 microlitros, 20,8 microlitros e 41,6 microlitros, respectivamente, de solução tampão tris HCL suplementada com E-D-T-A-P-M-S-F e DTT incubar por 30 minutos a 30 graus Celsius após cada adição, após a última incubação a 125 e depois 250 microlitros do tampão cloridrato de tris. Além disso, suplementado com glicerol P 40 sem débito e PSA em mais duas diluições de 30 minutos e 30 graus Celsius para cloreto de sódio 0,2 molar e 0,1 molar, respectivamente.

Em seguida, armazene o substrato mononucleossômico a quatro graus Celsius por até três meses antes de configurar os ensaios em géis de poliacrilamida nativos. Em seguida, para cada reação a ser realizada, combine cerca de 20 nanomolares em oh 80 com a quantidade apropriada de tampão EB 100 suficiente para dar um volume de 4,75 microlitros em um siliconizado pré-resfriado. O tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro recongela imediatamente qualquer NO 80 restante contendo frações, imp gelo seco em pó.

Em seguida, dispense 5,25 microlitros de coquetel mestre recém-preparado para cada tubo de reação, misturando bem pipetando para cima e para baixo. Em seguida, incube as reações em um bloco de calor de 30 graus Celsius. No final da incubação, adicione 1,5 microlitros de mistura de remoção recém-preparada a cada tubo para encerrar as reações e, em seguida, misture cada tubo de reação.

Bem, gire-os e incuba-os a 30 graus Celsius por mais 30 minutos. Enquanto isso, pré-execute o gel de poliacrilamida nativo em uma unidade de eletroforese vertical a 100 volts por 30 minutos a quatro graus Celsius, usando 0,5 XTBE como tampão de corrida com uma barra de agitação magnética dentro da câmara inferior para manter uma circulação de tampão constante no final da incubação com a mistura de remoção, misture 2,5 microlitros de matriz de carregamento com cada reação. E depois de uma breve rotação, use dicas de carregamento para carregar as amostras no gel.

Execute o gel a 200 volts por 4,5 horas a quatro graus Celsius com circulação tampão. Em seguida, transfira o gel para uma pilha de duas folhas de papel de filtro e solte os filtros de papel com o gel por cima usando filme plástico transparente para detectar o sinal. Exponha o gel a uma tela de fosfato de armazenamento a quatro graus Celsius pelo tempo desejado e, em seguida, escaneie a tela com um sistema de scanner de imagem de isótopos e analise os dados usando o software apropriado para realizar os ensaios de APAs dependentes de DNA e nucleossomo.

Comece combinando 10 a 50 nanomolares dos subcomplexos imunopurificados com uma quantidade de tampão eeb 100 suficiente para dar um volume de 2,2 microlitros em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro lubrificado pré-resfriado para cada reação e, em seguida, congele imediatamente qualquer fração contendo NO 80 em gelo seco em pó. Em seguida, misture suavemente 2,8 microlitros de subcoquetel recém-preparado contendo nucleossomos de DNA ou nenhum com a enzima contendo tubos de reação com pipetagem para cima e para baixo e transfira os tubos para um bloco de calor de 30 graus Celsius. Em seguida, use um lápis para desenhar uma linha muito leve a pelo menos 1,5 centímetros da borda inferior de um polietileno de 20 por 10.

Quero dizer cromatografia em camada fina ou placa TLC. Em seguida, coloque 0,5 microlitros de cada mistura de reação na linha em 5, 15, 30 e 60 minutos após a incubação, retornando imediatamente cada amostra ao bloco de calor, para que vários pontos de tempo possam ser obtidos de um único tubo. Depois de aplicar a última amostra, use um secador de cabelo para secar a placa e, em seguida, transfira a placa para uma câmara de vidro contendo o suficiente.

0,375 molar fosfato de potássio para permitir que os 0,5 centímetros inferiores da placa TLC sejam submersos na solução. Cubra a câmara e desenvolva a reação até que a frente da fase líquida atinja o topo da placa TLC, momento em que a placa deve ser imediatamente seca e exposta a uma tela fosfosfatada de armazenamento à temperatura ambiente. Finalmente, escaneie a tela com um sistema de scanner de imagem isotópica para determinar a quantidade de um substrato TP radioativo e um produto DP.

Este primeiro experimento demonstra que o complexo é purificado através da bandeira IES duas bandeiras, N-O-A-T-E e bandeira NO 80 delta N têm atividades semelhantes de deslizamento de nucleossomos, indicando que o terminal NO 80 N e ou suas subunidades associadas são dispensáveis para remodelação de nucleossomos pelo complexo NO 80. Em contraste, o complexo é purificado através da bandeira NO 80 delta n delta HSA estão inativos neste ensaio, indicando que a atividade de remodelação depende do domínio HSA dos APAs NO 80 e / ou suas subunidades associadas. Usando uma modificação do procedimento de ensaio deslizante do NUCLEOSSOMO, pode-se medir a atividade de ligação do nucleossomo dos complexos de remodelação da cromatina.

Neste experimento, a incubação dos nucleossomos com quantidades crescentes de complexos NO 80 intactos purificados através da subunidade NO 80 E levou a um desaparecimento dependente da dose da banda correspondente às zonas mononucleo livres e ao aparecimento de uma nova espécie deslocada que migrou perto do topo do gel. Em contraste, enquanto os nucleossomos foram incubados com complexos menores que foram purificados através do delta N NO 80 e que não tinham um subconjunto de subunidades NO 80, as espécies deslocadas migraram mais rapidamente, sugerindo que a mobilidade relativa da banda super deslocada é determinada pelo tamanho do ensaio dos complexos. Neste experimento final, são mostrados os resultados de um ensaio comparando as atividades de APAs ativadas por DNA e NUCLEOSSOMO de dois subcomplexos NO 80 diferentes.

As manchas de migração mais lenta correspondem ao alfa 32 P inicial rotulado como TP, e as espécies de migração mais rápida são os produtos da reação A DP com as áreas indicando a direção da migração do solvente. Ao usar esses procedimentos, é importante lembrar de realizar ensaios que variam em período de tempo e contêm diferentes concentrações de enzima. Isso garantirá que as medições sejam feitas quando as curvas de tempo e resposta à dose do produto forem lineares.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar as atividades de ligação de nucleossomos e deslizamento de nucleossomos de complexos de remodelação de cromatina purificada. Não se esqueça de que trabalhar com materiais radioativos pode ser perigoso. Deve-se tomar precauções como usar jaleco e proteção para os olhos, monitorar a contaminação radioativa e descartar adequadamente os resíduos radioativos.