זיהוי וניתוח של נזק לדנ"א בשרירי שלד עכבר באתר שימוש בשיטת TUNEL

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שברי DNA ומוות תאים ב-C שתיים. זה מושג על ידי קטעי רקמת סלסול ראשונים כדי לאפשר לריאגנטים של מנהרה להיכנס לגרעין התא. אנזים TDT הבא משמש לחיבור קוולנטי של DTPs לשלושה קצוות ראשוניים של שבירות DNA בתאים אלה.

ואז ה-DUTP מתויג עם בדיקה פלואורסצנטית. בסופו של דבר, האות החיובי של המנהרה מכומת בקטעי רקמה המשקפים את התדירות היחסית של שבירות DNA בתאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו כתמים דרומיים או אימונוהיסטוכימיה, הוא שהיא ספציפית מהירה יחסית ומספקת דרך לחסל רעש ואוטופלואורסצנטיות.

התחל בקיבוע גפיים אחוריות מבודדות ב-4%Para formaldehyde ב-PBS בצינור של 15 מיליליטר מאפשר לקיבוע להימשך ארבע עד לכל היותר 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. נדרשות רק שעתיים אם הרקמה עוברית. עם זאת, לאחר הקיבוע, החלף את התמיסה בסוכרוז של 10% כדי להגן על הרקמה ולדגור אותה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, החלף את התמיסה לסוכרוז 30% מסונן סטרילי והמשיך את הדגירה למשך הלילה או עד שהגפיים האחוריות שוקעות לתחתית הצינור. בעת ההטבעה, חשוב שהגפיים האחוריות יהיו שקועות לחלוטין במדיום ההטבעה. ניתן להניח את תבניות ההטבעה ישירות על קרח יבש או באיזופ פנטן על קרח יבש כדי להקפיא את המדיום.

בעת הקפאה. הבלוקים חותכים קטעי העברה בעובי 10 מיקרון או דקים יותר, קטעים עבים יותר לא יחדרו על ידי ריאגנטים לתיוג המנהרה. אסוף את החלקים הדקים הללו על גבי שקופיות זכוכית מצופות ג'לטין או וקטור בונד בטמפרטורת החדר.

מהר מאוד, העבירו את המגלשות לקרח יבש לאחסון. ראשית יש להפשיר שקופית של רקמה קפואה לטמפרטורת החדר ולתת לה להתייבש במשך 16 עד 64 שעות. לאחר שהמגלשה בטמפרטורת החדר, החזירו את החלק לצנצנת צימוד מלאה ב-PBS למשך 10 דקות.

חזור על שלב ההתייבשות הזה פעם אחת, ולאחר מכן יבש בזהירות את השקופית עם מגבון מעבדה מבלי להפריע לחלק הרקמה כדי לחלחל את הקטע, הנח את השקופית בתא לחות ופיפטה 50 מיקרוליטר של ריאגנטים מסחריים על בסיס ספונין שאינם פרוטאוליטיים על הקטע. אין לתקוע פיפטה ישירות על החלקים מכיוון שהיא עלולה להתנתק או להינזק. לאחר מכן הניחו חתיכה קטנה של סרט פרה מעל החלק כדי לפזר את המגיב.

אם נוצרות בועות, יש למרוח מחדש את סרט הפרה. תן למגלשה לדגור במשך שעה אחרי שעה. הסר את הריאגנטים באמצעות שתי שטיפות של חמש דקות ב-PBS וייבש אותו בזהירות.

לצד התווית שבירות DNA על ידי TDT, השתמש בערכה זמינה מסחרית. ראשית, הפוך את מאגר ה-XTDT האחד ופיפט מעל הקטע. לאחר מכן דגרו את המגלשה למשך חמש דקות בתא הלחות.

שנית, הכינו תערובת תיוג TDT בהתאם להוראות הערכה או שקופית בקרה חיובית. הוסף DNA לתערובת התיוג TDT. עבור שקופית בקרה שלילית, השמיט את אנזים ה-TDT מהתערובת.

כעת בעזרת מגבון, הסר כמה שיותר חיץ מהמגלשה ופיפטה אותו על תערובת התיוג. 50 מיקרוליטר אמורים להספיק. שוב, מורחים את התמיסה עם פרפורם מבלי ליצור בועות.

תנו למגלשה לדגור בתא למשך שעה עכשיו ב-37 מעלות צלזיוס. שלישית, צור את מאגר העצירה האחד לפי הוראות הערכה. לאחר הסרת תערובת התיוג עם מגבון המעבדה, הוסף בין שניים ל -300 מיקרוליטר מתערובת העצירה כדי לכסות לחלוטין את הקטע.

לאחר מכן דגרו את המגלשה למשך חמש דקות בתא. בשלב זה לא נעשה שימוש בסרט פרה. כדי להסיר את מאגר העצירה, השתמש בשתי שטיפות של שתי דקות ב-PBS.

עכשיו פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת תיוג פלואורסצאין טרי שהוכנה. על המגלשה, מרחו פרפיל ודגרו במשך 20 דקות בתא, אך כעת בחושך. הסר את תמיסת התיוג בשטיפה אחת של שתי דקות ב-PBS בזמן הכביסה ודלל כמה ווים.

3 3, 2, 5 8 למיקרוגרם אחד למיליליטר ב- PBS. לאחר השטיפות, מכסים את החלקים באחד עד 200 מיקרוליטר מתמיסת הווים המדוללת. לאחר מכן דגרו את המגלשה למשך חמש דקות, מוגנת מאור כדי להסיר את הווים להכתים, השתמשו בשלוש שטיפות של חמש דקות ב-PBS.

לאחר מכן יבש בזהירות את השקופית עם מגבון מעבדה והחל פתק כיסוי להדמיה. דמיין את הקטע באמצעות מסנני dpi, fitzy ואדום טקסס כדי להפריד את אותות כתמי הווים, כתם המנהרה והאוטופלואורסצנטי לשלושה ערוצי צבע כוזבים בתמונה אחת. תקנן ושמור על אותן הגדרות הדמיה בין כל השקופיות כך שניתן יהיה להשוות אותן בקלות.

אל תשתמש בהגדרות חשיפה או רווח אוטומטיות לעיון אנטומי. השתמש בתמונת שדה בהיר של קטע גפה אחורית סמוך מוכתם ב-h ו-e בתוכנת ניתוח התמונה. כבה את ערוץ המנהרה.

לאחר מכן עקוב ידנית אחר קווי המתאר של אזור השריר שיש לכמת באמצעות הערוצים האחרים. המירו את אזור העקיבה למסיכה. לאחר מכן הפעל שוב את תעלת המנהרה והתאם את סף העוצמה המינימלי כדי לא לכלול אות אוטו-פלואורסצנטי.

השתמש באותה מגבלת סף בכל הסעיפים שנותחו במחקר. לאחר מכן, המירו את פיקסלי הסף למסיכה. בכל תמונה, שלב את מסכת אזור השרירים ומסכת מנהרת הסף.

זה מייצג את אות המנהרה בתוך אזור השריר המעקב. כעת כמת את המסכה המשולבת כדי לקבוע את מספר האובייקטים החיוביים במנהרה ואת שטח הפיקסלים הכולל של אות המנהרה בתוך השריר. השתמש בערכים אלה לניתוח סטטיסטי.

עצמים חיוביים מנהרה שהגדלה נמוכה עשויים להופיע כשברים בהירים לא סדירים בשריר השלד. עם זאת, בהגדלה גבוהה יותר, יש להבחין בכמה עצמים חיוביים במנהרה עם המורפולוגיה האפופטוטית הקלאסית אם סוג מוות התאים היה מעורב באפופטוזיס זה. הבקרה החיובית עם תוספת DNA D אמורה להציג אות חיובי מנהרה בשפע המופץ באופן אחיד על פני כל הרקמות.

במקטע. הבקרה השלילית ללא אנזים TDT צריכה להיות בעלת רקע בעוצמה נמוכה ולהראות רק אוטופלואורסצנטיות. עם הפרוטוקול המתואר, נמצא כי תאי העצם והאנדותל של RBC תרמו לאות האוטו-פלואורסצנטי בקטעי הגפיים הגבוהים המוכנים.

האות החיובי האמיתי של המנהרה היה הרבה יותר אינטנסיבי. ניתן לבודד אותו מהאות האוטו-פלואורסצנטי באמצעות סף עוצמת פיקסלים. אפשרות נוספת לבודד את אות המנהרה הייתה להחסיר דיגיטלית את תעלת האוטופלואורסצנטיות האדומה מתעלת המנהרה.

באמצעות טכניקה זו, מוות של תאי שריר השלד. במודל עכבר של SMA הוערך, תיוג מנהרה חשף יותר תאים אפופטוטיים בעכברי SMA בני חמישה ימים מאשר בביקורת. על ידי כימות צביעת המנהרה, תצפית זו הוכחה כמובהקת סטטיסטית עבור קבוצות שרירים מרובות בתוך הגפה האחורית.

לאחר שליטה, ניתן לבצע את טכניקת המנהרה תוך כארבע שעות כדי לייצר תוצאות כמותיות אמינות.