고립의 방법

본 절차의 전반적인 목표는 재현 가능한 결과를 얻을 수 있는 일관된 쥐의 ex vivo 폐 관류 모델을 구축하는 것입니다. 첫 번째 단계는 기관을 삽관하고 기계적 환기를 시작하는 것입니다. 다음으로, 폐동맥과 좌심방을 삽관합니다.

마지막 단계는 가슴강에서 심폐 블록을 제거하여 ex vivo 폐 관류 회로에 배치하는 것입니다. 최종적으로, 폐동맥압 및 기타 파라미터를 측정하여 폐의 상태를 실시간으로 나타내기 위해 압력 센서, 중량 트랜스듀서 및 혈액 가스 분석기가 사용됩니다. Ex vivo 폐 관류는 폐 이식을 위한 공여자 풀을 확장할 수 있게 해준 획기적인 기술입니다.

우리는 이 기술이 장기 평가 플랫폼으로 활용됨으로써 이식될 장기의 품질과 전반적인 이식 성적을 향상시킬 수 있을 것으로 기대합니다. 여기 Copper 연구소에서는 장기를 평가하고, 재형성 또는 복구한 후, 장기를 수정하여 품질을 높이고 결과적으로 이식 성적을 개선하는 것을 '장기 무장화(arming the organ)'라고 명명했습니다. 우리는 ex vivo 폐 관류의 견고하고 재현 가능한 소동물 쥐 모델을 개발하였습니다.

본 영상을 통해 관류 및 이식 연구의 플랫폼으로 활용될 수 있는 ex vivo 폐 관류 모델을 구축하기 위한 핵심적이고 중요한 단계들을 시연하겠습니다. 우선 EVLP 회로를 구성하고 시스템 전체에 따뜻한 관류액을 순환시키는 것으로 시작하십시오. 항온수조, 열교환기 및 인공 흉강의 온도를 37 °C로 설정하십시오.

가스 필터에 저산소 가스를 통과시켜 PERFUSE 8 내의 용존 산소 농도가 실험에 적합한 약 6%가 되도록 유지합니다. 데이터 수집 프로그램을 실행한 후, 폐동맥압 트랜스듀서, 기관 차압 트랜스듀서, 호흡 유량 차압 트랜스듀서, 폐 중량 트랜스듀서 및 펌프 속도 트랜스듀서를 아날로그-디지털 변환기 박스에 연결합니다. 마지막으로, 수술대를 설치하고 시술에 필요한 모든 수술 도구와 소모품을 준비합니다.

발가락 꼬집기(toe pinch)로 진정 상태를 확인한 후, 마취된 동물을 수술대 위에 앙와위(supine position)로 눕힙니다. 데이터 수집 프로그램을 사용하여 데이터 기록을 시작합니다. 준비가 되면 복강으로 진입하여 하대정맥(inferior vena cava)에 헤파린을 주입합니다.

표준 절차에 따라 기관을 삽관하고 캐뉼라를 환기 회로에 연결하십시오. 기계식 인공호흡기를 켜서 폐에 기계적 환기를 시작합니다. 다음으로, 폐에 닿지 않도록 주의하며 흉강을 견인하여 폐를 노출시키십시오.

흉선을 제거하고 복강 내 장기를 한쪽으로 밀어 하대정맥 또는 장간막 정맥을 노출시킵니다. 안락사 후, 폐동맥과 대동맥 뒤쪽에 실크 봉합사를 배치합니다. 폐동맥 캐뉼라를 고정하기 위해, 우심실 유출로의 전면에 2~3mm 절개를 가하고 메인 폐동맥에 캐뉼라를 삽입합니다.

실크 봉합사로 고정한 후, 폐동맥을 통해 약 15 milliliters의 저칼륨 양이온 전해질 용액을 주입하고 심장 첨단으로 배출시켜 폐혈관 내의 혈전을 제거합니다. 다음으로 심장 뒤쪽과 심실 주위에 실크 봉합사를 배치합니다. 이첨판을 확장하여 캐뉼라 삽입을 용이하게 하려면, 작은 외과용 포셉을 이첨판을 통해 심장 첨단에서 좌심방으로 삽입합니다.

준비가 되면, 승모판을 통해 심첨부에 캐뉼라를 삽입하고 좌심방으로 진입시킵니다. 실크 봉합사로 좌심방 캐뉼라를 고정합니다. 다음으로, 폐동맥 캐뉼라를 EVLP 회로에 연결합니다.

회로에서 나오는 유입 라인이 perfuse eight으로 프라이밍되었는지 확인하십시오. 공기가 심장과 폐로 들어가는 것을 방지하기 위해 메인 연동 펌프를 켜고 저속으로 설정하십시오. 이렇게 하면 perfuse eight이 폐동맥을 통해 흐르고 좌심실을 통해 흉강으로 배출됩니다.

폐동맥압을 모니터링하여 폐쇄 또는 캐뉼라 삽입 불량을 나타내는 급격한 압력 상승이 발생하지 않는지 확인하십시오. 준비가 되면 연동 펌프를 끕니다. 폐동맥 캐뉼라를 ex vivo 폐 관류 회로에 연결하십시오.

심폐 블록을 체내에서 제거할 때까지 좌심방 캐뉼라를 회로에 연결하지 마십시오. 지혈겸자로 식도를 고정한 후 클램프 아래쪽을 절단하여 식도를 이용해 심폐 구조물을 둔탁하게 들어 올릴 수 있게 합니다. 주변 조직을 박리하고 하행 대동맥과 보조 혈관들을 절단하며 식도를 통해 심폐 블록을 들어 올려 분리하십시오. 기관을 절단하여 심폐 블록을 완전히 분리한 후, EVLP 회로의 지정된 위치에 배치합니다.

그 다음 좌심방 캐뉼라를 유출 라인에 연결하고 연동 펌프를 작동시킵니다. 환기 데이터를 기록하고 압력을 모니터링하기 위해 EVLP 장치 상단에서 환기 라인을 신속하게 제거하고 압력 센서가 포함된 하우징을 부착합니다. 이어서 환기 라인을 EVLP 장치 상단에 다시 삽입합니다.

버블 트랩에 관류액이 충분히 채워져 있는지 확인하십시오. 초기 15분 동안 폐에 공기 방울이 유입되는 것을 방지하기 위해, 환기 및 관류 설정을 원하는 실험 수준으로 천천히 변경하십시오. 또한 이 초기 램프업 단계 동안 관류 유량과 압력을 원하는 수준까지 높이십시오.

폐 공간 밖으로의 액체 배출을 촉진하고 부종의 발생을 지연시키기 위해 인공호흡기에 간헐적인 측면 호흡을 생성하도록 설정하는 것이 권장됩니다. 환기 파라미터가 4 mL/kg의 일회 호흡량과 2 cm H₂O의 호기말 양압 상태가 된 시점을 0시점으로 정의하십시오.

H2O 및 관류 파라미터가 예상 수준이며 일정하게 유지되고 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 샘플 포트에서 8개의 관류 샘플을 채취하여 액체 질소에 급속 냉동시키고, 샘플 채취 시간을 기록합니다. 실험이 완료되면 수집에 필요한 해부학적 부위를 분리하여 액체 질소에 급속 냉동하거나, 추후 연구를 위해 고정액에 넣습니다.

수컷 Sprague Dawley 쥐의 폐 무게는 ex vivo 폐 관류 시작 후 첫 10분이 지난 뒤, 60분 동안 유의미한 변화가 없었습니다. 폐동맥압 또한 변화가 없었습니다. 마찬가지로, 폐혈관 저항 역시 연구 기간 내내 변경되지 않았습니다.

높은 일회 호흡량과 높은 PEEP 조건에서 1시간 동안 인공 호흡을 실시한 결과, PERFUSE 8 그룹에서 전염증성 사이토카인 농도가 증가한 반면, 항염증성 사이토카인 농도는 변화가 없었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 귀하의 실험실에서 쥐를 이용한 소동물 ex vivo 폐 관류 모델을 구축하는 데 필요한 주요 단계들을 충분히 이해하게 될 것입니다.