Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma população purificada de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Primeiro, as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos são cultivadas em uma monocamada celular até que sejam cerca de 85% confluentes. Um composto de pequena molécula que ativa a via de sinalização das células eólicas é então adicionado e as células são incubadas por dois dias para induzir a formação do mesoderma.

Em seguida, um composto de pequena molécula que inibe a via de sinalização das células eólicas é adicionado às células para especificar a diferenciação do mesoderma cardíaco. As células são então incubadas por mais dois dias. No sétimo dia, os cardiomiócitos diferenciados vencem a população de células diferenciadas heterogêneas e são incubados em um meio de cultura de células com baixo teor de glicose para purificar seletivamente os cardiomiócitos.

Finalmente, as células são inspecionadas visualmente sob um microscópio óptico e analisadas por citometria de fluxo para confirmar a produção de uma população altamente purificada de cardiomiócitos batedores. A principal vantagem dessa técnica sobre outros protocolos de diferenciação de cardiomiócitos que utilizam moléculas pequenas é que ela emprega uma etapa adicional de privação de glicose. Isso nos permite purificar os cardiomiócitos, que são capazes de utilizar outras fontes de energia celular além da glicose.

Os não cardiomiócitos podem ser eliminados seletivamente dessa população heterogênea de células diferenciadas. Os cardiomiócitos podem então ser utilizados para fins a jusante, como modelagem de doenças in vitro ou descoberta de medicamentos de alto rendimento. Ensaios Prepare-se para este experimento com placas de seis poços Preco com solução de matriz extracelular ou ECMS e descongelamento, um frasco de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos congeladas, ou HI PSCs, conforme descrito no texto anexo.

Após a centrifusão Resus, suspender as células descongeladas em E oito com inibidor de rocha. Em seguida, transfira o conteúdo do frasco para um poço de uma placa de seis poços pré-codificada com ECMS. Coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após 24 horas, as células terão aderido. Substituir o meio por meio E oito sem inibidor de rochas. Continue a cultivar as células e substitua o meio E oito diariamente.

Quando os PSCs HI atingem 75 a 80% de fluência, é hora de passá-los. Aspire o meio de cultura rapidamente. Lave os poços com um mililitro de PBS estéril em temperatura ambiente aspire o PBS.

Em seguida, adicione 500 microlitros de EDTA 0,5 milimolar ou outra solução de descolamento celular. Incube por um a sete minutos em temperatura ambiente usando um monitor de microscópio, descolamento celular quando o enrolamento ou espessamento visível das colônias ao redor das bordas for evidente, aspire a solução de descolamento celular. Em seguida, adicione um mililitro de meio E oito suplementado com inibidor de rocha 10 micromolar usando um P 1000 repetidamente pipeta para cima e para baixo para separar completamente as colônias H-I-P-S-C da placa, formando de cinco a 10 aglomerados de células.

Em seguida, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros para dispersar ainda mais a célula grande. Aglomerados, pipetar para cima e para baixo até que aglomerados menores se formem, como mostrado aqui. Em seguida, dilua as células de um a 12 adicionando 11 mililitros de meio E oito com inibidor de rocha à suspensão de células de um mililitro.

Em seguida, aspire o ECMS das placas pré-codificadas. Placas e adicionar dois mililitros de células ressuspensas a cada poço aproximadamente 100.000 células por poço de um poço de seis é o objetivo ideal de dispensar as células uniformemente ao redor do poço para evitar o agrupamento de células no centro do poço. Coloque a placa na incubadora por 24 horas.

No dia seguinte, substitua o meio por E oito que não contenha inibidor de rocha. Troque o meio a cada 24 horas até que as células se tornem 80% confluentes. Normalmente, as células estão prontas para passar novamente dentro de três a seis dias após a dissociação com EDTA ou uma semente de solução de descolamento Xcel, aproximadamente 100.000 PSCs I humanos em placas de cultura de seis poços revestidas com ECMS para diferenciação.

Seguindo os mesmos passos utilizados para HI PSCs quando as células atingem 85% de fluência de co mudam para R-P-M-I-B 27, meio sem insulina, mas com seis micromolares do inibidor beta de GSK três. CHIR 9 9 0 2 1. Incube as células por 48 horas por dia, examine as células ao microscópio.

Quantidades substanciais de morte celular podem ser observadas após 24 horas de tratamento com CHI. Isso é normal e comumente visto após dois dias de tratamento. O HIPS vê um aumento de tamanho e número e continua a se diferenciar em direção a um destino mesodérmico.

Substitua o meio de cultura contendo CHIR pelo meio de insulina R-P-M-I-B 27 e incube até o terceiro dia. No terceiro dia, troque o meio para R-P-M-I-B 27 sem insulina. Com cinco inibidores de vento micromolares IWR um e incubar as células por 48 horas.

No quinto dia, examine as células ao microscópio. As células mesodérmicas devem ser direcionadas para a linhagem cardíaca e começar a coalescer e formar estruturas semelhantes a ramos característicos. Mude o meio de volta para R-P-M-I-B 27 sem insulina e incube as células por 48 horas.

No sétimo dia. Substitua o meio por R-P-M-I-B 27 contendo insulina a cada três dias a partir de então, substitua pelo mesmo meio entre o oitavo e o 10º dia. O batimento espontâneo dos cardiomiócitos será visto após 10 dias de diferenciação.

Mais de 50% das áreas de células estão batendo. No entanto, as folhas de células batendo podem ser misturadas com não cardiomiócitos no 10º dia, estruturas semelhantes a ramificações serão altamente pronunciadas. Os cardiomiócitos diferenciados terminalmente não proliferarão além desse ponto.

No dia 10. Após a diferenciação, mude o meio em cada poço da placa de seis poços para dois mililitros de meio com baixo teor de glicose e mantenha as células neste meio por três dias até o dia 13. No dia 13, retorne as células ao meio R-P-M-I-B 27 com insulina ou, opcionalmente, para reinflar as células, o que facilita a dissociação de não cardiomiócitos durante a falta de glicose.

Aspire o meio e lave uma vez com PBS. Adicione 500 microlitros de enzima de dissociação celular e incube as células por cinco minutos. Após cinco minutos de tratamento enzimático, use um P 1000 para dispersar manualmente os cardiomiócitos em uma única suspensão celular Pipetando para cima e para baixo até 30 vezes após a dissociação das células, transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.

Preenchido com cinco mililitros de meio R-P-M-I-B 27 com insulina para diluir a enzima de dissociação celular, centrifugue por quatro minutos a 200 Gs após o aspirado de spin e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células em dois mililitros de meio R-P-M-I-B 27 e semeie-as em uma nova placa de seis poços revestida com ECMS. Normalmente, a sobrevivência celular é aumentada com a confluência para uma sobrevivência celular ideal.

Reflate 2 milhões de células por poço em um prato de seis poços Para células, não replaqueadas. No 14º dia, troque o meio de volta para dois mililitros de meio com baixo teor de glicose para uma segunda cultura do ciclo de privação de glicose. As células neste estado de baixa glicose por mais três dias.

A maioria dos não cardiomiócitos morrerá no 17º dia. Troque o meio para dois mililitros de R-P-M-I-B 27 com insulina. As células restantes serão altamente purificadas. Cardiomiócitos.

Essas células podem ser usadas para análise de expressão gênica, triagem de drogas, análise metabólica e vários outros ensaios a jusante para examinar a pureza dos cardiomiócitos após a diferenciação e purificação via método de falta de glicose, células com imunocoloração contra marcador de cardiomiócitos, tropina cardíaca e T CTN T foram caracterizados. A microscopia de imunofluorescência de uma população não purificada de células diferenciadas revelou que, embora muitas células fossem CTN T positivas mostradas em verde, muitas células não tinham expressão de CTN T, sugerindo a presença de não cardiomiócitos no dia 13. Em contraste, após uma falta de glicose de três dias começando no dia 10, quase todas as células foram positivas para CTNT no dia 13, indicando purificação bem-sucedida dos cardiomiócitos após a falta de glicose.

Esses dados foram corroborados por meio da análise por citometria de fluxo. Conforme indicado em vermelho, cerca de 50% das células que não sofreram falta de glicose foram tn NT dois positivos. Enquanto 90% das células carentes de glicose foram tn NT dois positivos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em populações altamente purificadas de cardiomiócitos. Essas células purificadas podem ser produzidas de forma de alto rendimento para uma variedade de aplicações in vitro a jusante. Ao cultivar células-tronco pluripotentes, lembre-se de que elas não devem crescer até cem por cento de cofluência antes da mensagem.

Algumas linhagens de células-tronco se diferenciam melhor quando a cofluência inicial de células-tronco pluripotentes é inferior a 85%Finalmente, algumas linhagens de células-tronco podem responder mais rápida ou severamente à etapa de privação de glicose. Sempre monitore esses parâmetros antes de trabalhar com novas linhagens de células-tronco.