Desarrollo y mantenimiento de un tumor del paciente preclínicos Derivado modelo de xenoinjerto para la Investigación de Novela Anti-Cancer Therapies

El objetivo general de este procedimiento de xenoinjerto tumoral subcutáneo derivado del paciente es estudiar la eficacia de nuevas terapias, el descubrimiento predictivo de biomarcadores y las vías de resistencia a los fármacos en los tumores. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oncología sobre si un medicamento en particular exhibe actividad contra un tipo de tumor específico. La principal ventaja de esta técnica es que las xenografías tumorales derivadas del paciente mantienen la heterogeneidad molecular, genética e histológica propia de los tumores de origen, lo que hace que el modelo sea más relevante clínicamente.

Stacey Bagby, asistente de investigación profesional y técnica veterinaria certificada de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. Después de recolectar de uno a dos mililitros de sangre en un tubo de separación de células sanguíneas que contiene citrato de sodio, centrifugar las muestras y transferir la capa de células mononucleares de sangre periférica a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Llene el tubo hasta la parte superior con PBS estéril.

A continuación, vuelve a girar las celdas. Seguido de un lavado rápido con un mililitro de PBS, teniendo cuidado de no alterar el pellet de PMBC. A continuación, utilice una pipeta para transferir el plasma del tubo de recogida de células sanguíneas a un vial criogénico estéril de 1,5 mililitros, y almacene el plasma y el gránulo de PBMC a 80 grados centígrados negativos.

Transfiera el tejido tumoral humano a la instalación de animales en un recipiente estéril que contenga medio completo y coloque el recipiente en una campana de flujo laminar. Tan pronto como sea posible, después de la recolección, transfiera el tejido a un plato de corte de plástico estéril en una pequeña cantidad del medio de recuperación. Luego, usando tijeras y pinzas pequeñas esterilizadas en autoclave, corte el tejido en trozos de aproximadamente tres por tres por tres mililitros y coloque de 10 a 12 piezas en un tubo de microcentrífuga esterilizado en autoclave de 1,5 mililitros que contenga 300 microlitros de solución de mezcla de proteínas gelatinosas en hielo para la implantación.

Para el almacenamiento instantáneo congelado, transfiera el número adecuado de piezas tumorales a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y coloque el vial en un dosificador de nitrógeno líquido. Luego, colóquelo en un congelador a menos 80 grados centígrados. Para la fijación formal y la inclusión de parafina, coloque tres pequeñas piezas de tumor en un vaso de 10 mililitros de formalina al 10% durante 24 horas.

Después de que los tejidos se procesen en bloques incrustados en parafina, transfiera las piezas de tejido restantes a un tubo criogénico. A continuación, añada un mililitro de medio completo suplementado con 10% de DMSO al pañuelo y almacene los tubos en hielo hasta que puedan transferirse a un recipiente de congelación de alcohol isopropílico. Y pon ese recipiente en un congelador a menos 80 grados centígrados.

Para inyectar el tejido tumoral, cargue las piezas de tumor almacenadas en la solución de mezcla de proteínas gelatinosas en trócares de calibre 12 esterilizados en autoclave, teniendo cuidado de que cada pieza tumoral se inserte completamente en el trócar. A continuación, confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón atímico desnudo de seis a ocho semanas de edad y transfiera el ratón a un campo limpio en una campana de flujo laminar estéril. Administrar el tumor F0 por vía subcutánea a la región dorsal del cuello y a cada lado del flanco del ratón, seguido de la administración subcutánea de analgesia distal a uno de los sitios del flanco de la inyección tumoral.

Luego, vuelva a colocar al ratón en su jaula con monitoreo hasta que se recupere por completo. Monitoree el crecimiento y la salud de los ratones implantados con xenógrafo al menos una vez por semana, registrando el tamaño de los tumores, la generación del tumor, la fecha de inyección del tumor y la salud de los ratones en un sistema de seguimiento adecuado. Cuando un tumor alcanza aproximadamente 1.500 a 2.000 milímetros cúbicos de tamaño, use tijeras y fórceps esterilizados en autoclave para extirpar el tumor y pasar el tumor F1 a la siguiente generación de cinco animales, como se acaba de demostrar, teniendo cuidado de recolectar formalina congelada rápidamente y muestras de tumores viables como se demostró para cada tumor.

Cuando los ratones restantes del grupo de tumores F0 exhiban tumores de aproximadamente 1.500 a 2.000 milímetros cúbicos de tamaño, recoja estos tumores como se acaba de demostrar para su recolección. Cuando se alcance la generación de tumores en estadio F15, se use la generación más temprana de fragmentos tumorales viables disponibles en el almacenamiento de nitrógeno líquido para la siguiente serie de inyecciones tumorales. Cuando el tumor deseado es muy grande, de 1.500 a 2.000 milímetros cúbicos, siga los procedimientos anteriores para recolectar el tumor y expandirlo a la cantidad deseada de ratones.

Dosifique a los ratones con el medicamento y péselos y mídalos dos veces por semana. Aleatorice los ratones en grupos de tratamiento con 10 tumores por grupo y un promedio de volumen tumoral grupal de 100 a 300 milímetros cúbicos con unas pocas desviaciones estándar entre sí. Luego, clasifique a los ratones en los grupos apropiados para el tratamiento.

La hibridación in situ de fluorescencia de doble color para el ADN humano y ratón capturado demuestra que las células estromales humanas en el tumor F0 son reemplazadas por las células estromales de ratón en el tumor F1. Mientras que todo el factor de crecimiento de hepatocitos de origen humano en la generación F0 se reemplaza con el factor de crecimiento de hepatocitos de ratón en la generación F1, el ligando del factor de crecimiento endotelial vascular consta de proteínas humanas y de ratón en la generación F1. El tratamiento de diferentes generaciones del mismo tumor no cambia la respuesta al tratamiento.

Con la resistencia o sensibilidad del tumor que parece ser una cepa tumoral en lugar de una generación tumoral específica. Además, la frecuencia de mutaciones en estos genes comúnmente mutados es muy similar entre el atlas del genoma del cáncer y el banco de xenógrafos de tumores derivados de pacientes colorrectales. Lo que sugiere que las mutaciones comunes observadas en la población de pacientes colorrectales están bien representadas en el modelo de xenotrasplante derivado de pacientes colorrectales.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en una o dos horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante contar con un equipo clínico cohesionado para identificar y obtener el consentimiento de los pacientes con cáncer y para la extirpación y macroscopía del tejido tumoral. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la investigación de compuestos anticancerosos como agentes únicos o combinados, para responder preguntas adicionales sobre la viabilidad de estas estrategias para los pacientes con un tipo de tumor en particular.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la oncología exploraran nuevas terapias contra el cáncer, la heterogeneidad tumoral, los mecanismos resistentes al tratamiento, la biología de las células madre cancerosas y las interacciones del estroma tumoral. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar y mantener un modelo de xenógrafo tumoral derivado del paciente para evaluar nuevas terapias contra el cáncer.