In Vivo Rilevamento e analisi di Rb sumoilazione di proteine in cellule umane

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di rilevare la SUMOilazione delle proteine del retinoblastoma in condizioni endogene ed esogene nelle cellule umane. Le piccole proteine della famiglia dei modificatori correlati all'ubiquitina, o SUMO, sono coniugate ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare vari processi cellulari. Di solito, è più difficile avviare una proteina SUMOilazione nelle cellule a causa della complessità della SUMOilazione in vivo.

Questo esperimento rileva la SUMOilazione di proteine Rb sia endogene che esogene. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla SUMOilazione delle proteine Rb, è anche appropriato per il rilevamento di molte altre proteine bersaglio SUMO nelle cellule. Per iniziare, aggiungere 25 millilitri di DMEM contenente l'uno per cento di penicillina streptomicina e incubare le cellule HEK293 a 37 gradi Celsius per 72 ore.

Lavare le cellule dalla piastra usando tre millilitri di PBS ghiacciato. Quindi trasferire le cellule in una nuova provetta da cinque millilitri. Per ottenere cellule in fase G1 alla fine del processo di sincronizzazione G0, rimuovere il DMEM e aggiungere nuovamente terreno di crescita fresco, consentendo così alle cellule HEK293 di rientrare nel ciclo cellulare.

Quindi raccogliere le cellule in diverse fasi G1 per l'analisi del ciclo cellulare e l'ulteriore saggio SUMO. Per sincronizzare le cellule HEK293 nella fase S, utilizzare il metodo del doppio blocco di timidina. Innanzitutto, fai crescere le cellule HEK293 fino a una confluenza del 50%, quindi lava le cellule con PBS preriscaldato.

Aggiungere il terreno di crescita integrato con 2,5 millimolari di timidina per 18 ore come primo blocco. Rimuovere il terreno contenente timidina e lavare le cellule due volte con PBS preriscaldato. Aggiungere un terreno di coltura fresco per 14 ore per rilasciare le cellule dal blocco.

Dopo aver rilasciato le cellule dal primo blocco, scartare il terreno con una pipetta. Quindi aggiungere il terreno di crescita integrato con timidina 2,5 millimolare per altre 18 ore come secondo blocco prima di condurre un'analisi del ciclo cellulare e della sumoilazione di Rb. Per la sincronizzazione di fase G2, o M, piastrate circa 15 milioni di cellule HEK293 su una piastra di 15 centimetri con 25 millilitri di terreno di crescita e fate crescere per 24 ore.

Quindi aggiungere nicotisolo al terreno fino ad ottenere una concentrazione finale di 400 nanogrammi per millilitro. Infine, incubare le cellule per 16 ore prima di condurre l'analisi del ciclo cellulare mediante citometria a flusso come descritto nel protocollo di testo. Lisi le cellule HEK293 sincronizzate risospendendole delicatamente in un millilitro di saggio di radioimmunoprecipitazione a freddo ghiacciato, o RIPA, tampone di lisi contenente un inibitore dell'isopeptidasi appena aggiunto per bloccare le proteasi SUMO e stabilizzare i coniugati SOMO.

Omogeneizzare ulteriormente le cellule sul ghiaccio facendole passare attraverso un ago calibro 21 attaccato a una siringa da due millilitri 10 volte. Quindi incubare le cellule sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi, centrifugare i lisati cellulari a 18000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, trasferire i surnatanti in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Ai surnatanti, aggiungere un microgrammo di immunoglobulina G di topo non specifica della stessa specie e isotipo dell'anticorpo monoclonale Rb. Inoltre, aggiungere 20 microlitri di sephyroslur proteico AG al 50%, quindi incubare la miscela per un'ora a quattro gradi Celsius con una leggera rotazione.

Centrifugare i campioni a tremila volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere con cura i surnatanti senza disturbare le perle e trasferirli in nuove provette da microcentrifuga da un virgola da cinque millilitri. A ciascuno dei campioni, aggiungere cinque microlitri di anticorpo primario rb e 40 microlitri di sefirosliquame proteico ag al 50%, quindi incubare i campioni durante la notte a quattro gradi Celsius con una leggera rotazione.

Dopo la centrifugazione, lavare le perle con un millilitro di tampone rifa. Mescolare bene i tubi ruotandoli a quattro gradi centigradi per 15 minuti. Quindi raccogliere le perle mediante centrifugazione a bassa velocità come prima e scartare i surnatanti.

Dopo aver eseguito il lavaggio quattro volte, risospendere le perle in 30 microlitri di un tampone di caricamento per elettroforesi su gel di sodio dodecalsolfato di poliacirlimide e mescolare bene. Incubare le provette a 100 gradi Celsius in un blocco termico per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 12 mila volte g per un minuto per pellettare le perline.

Infine, raccogliere con cura i surnatanti senza disturbare le perle e trasferirle in un punto di provette da microcentrifuga da cinque millilitri. Eseguire la trasfezione di colture cellulari e la lisi cellulare di cellule HEK293 come descritto nel protocollo di testo. Quindi lavare 25 microlitri di perle di acido nicrolotriacetico al 50% di nichel con tampone ripa in una provetta da microcentrifuga da cinque millilitri per ogni campione.

Raccogliere le perle per centrifugazione a tremila volte g per tre minuti a quattro gradi centigradi. Aggiungere un emitozolo molare a ciascun campione per ottenere una concentrazione finale di 10 millimolari. Quindi aggiungere ogni campione alla provetta contenente le perle di agoros preparate.

Incubare le perle e i lisati per due ore a quattro gradi centigradi con una leggera rotazione. Quindi girare le perline a tremila volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela i surnatanti mediante pipettaggio.

Per evitare la perdita di perline, non aspirare le perle a secco. Quindi, lavare le perle con un millilitro di tampone di lavaggio contenente 20 millimolari di emitozolo. Mescolare bene i tubi ruotandoli a quattro gradi centigradi per 15 minuti prima di raccogliere le perline mediante centrifuga.

Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 microlitri di tampone Eleusian contenente 250 millimolari di emitozolo a ciascun campione e mescolare con un colpo. Quindi incubare i campioni per 20 minuti a quattro gradi Celsius per eluire le proteine. Mescola ogni campione con sei buffer di caricamento della pagina SDS.

Quindi incubare le provette a 100 gradi Celsius in un blocco termico per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, caricare i campioni di immunoprecipitazione o di estrazione su gel per pagine SDS con gradiente dal quattro al 20 percento. Condurre l'elettroforesi a 120 volt per 90 minuti per separare le proteine.

Dopo la sincronizzazione del ciclo cellulare e l'immunoprecipitazione delle specie endogene di rb, la presenza del segnale SUMO è stata specificamente rilevata da un anticorpo anti SUMO one nella fase iniziale G1. Risultati rappresentativi mostrano la SUMOilazione forzata della proteina rb fondendo direttamente l'enzima SUMO E2 UBC9 al suo terminale C. Si noti la proteina rb SUMOilata a migrazione più lenta.

Utilizzando il mutante carente di SUMO di rb, K720R, la presenza di rb SUMOilazione nelle cellule è ulteriormente confermata. Quindi, in questa procedura, molte altre proteine bersaglio di SUMO possono essere analizzate in cellule in coltura. Nella maggior parte dei casi solo una piccolissima porzione di un substrato è SUMOilata, quindi mentre si tenta questa procedura è importante ottimizzare l'efficienza dell'immunoprecipitazione.