密度勾配遠心
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Overview
密度勾配遠心分離し、生体分子や細胞構造を浄化するために使用する一般的な手法であります。この手法は、懸濁液、溶媒よりもより密な粒子が堆積物、それらがより少なく密が浮かびますしながら事実を悪用します。高速遠心がこのプロセスを加速する密度勾配遠心管中の密度を減少させるレイヤリング液体によって確立することができます内の生体分子を分離するために使用されます。
ビデオ、サンプル準備、ショ糖密度勾配、超遠心分離と分別された検体のコレクションの作成を示すプロシージャを含む密度勾配超遠心法の原理を説明します。アプリケーションでは、核酸の複合体、およびセシウム塩化密度勾配を用いた分離の分離多蛋白質の複合体の分離を説明します。
密度勾配遠心分離および生化学的な実験のための細胞構造を浄化する一般的な方法であります。手法は、非破壊の密度勾配で細胞成分を分離するのに高速、または、超遠心分離機を使用します。このビデオは、密度勾配超遠心法の原理を説明します、ショ糖密度勾配を使用して一般的な手順について説明します、いくつかのアプリケーションについて説明します。
Ultracentrifuges と密度勾配の原理を調べることから始めましょう。懸濁液には液体溶媒中の粒子が含まれています。重力のため溶媒の土砂よりも密度の高い粒子は溶媒のフロートよりもそれらのアウトします。密度の違い、粒子と溶媒、高速の分離。
超遠心機には、強力な重力場をシミュレートする、高度に制御速度で回転するローターと呼ばれるユニットが含まれています。このフィールド内で粒子と溶媒の密度の違いが拡大されます。
磁場の強さは、回転数によって異なります。比較的低回転速度でさえ小さなローターは地球の引力よりも強い回の力の何千もを作成できます。
チューブには、別の密度の液体が含まれている場合、遠心分離はベースに最も近い最も高密度の液体で、密度の順序で別のレイヤーで彼らに維持されます。複数液体のようなレイヤーが「密度勾配”と呼ばれる2 つのタイプがあります。グラデーションのステップで、密度の減少の液体が慎重に互いをトップ階層。連続的な勾配で液体は密度は上向きの基地からスムーズに減少するのでさまざまな比率で混合されます。
細胞細胞器官は「密度密度勾配遠心」を通じて、ステップ グラデーションを使用して分けることができるこれは最も簡単で、最も一般的なの遠心分離の手順です。
このプロシージャは、セル構造を分離する使用です。密な細胞小器官、さらにそれを下る-上部と下部の核酸のミトコンドリアと。
技術の背後にある原理を理解すると、ラボでしてみましょう。
手順を開始する前に、製造元の速度と密度の評価を注意してください、超遠心機チェック腐食。この手順は、スイング バケツの回転子を使用します。
まず、細胞材料は、非破壊的リリースの細胞小器官細胞を均質化によって準備されます。磨砕液は、低密度のコンポーネントを削除する、予備の低速遠心による分別があります。次に、ショ糖ソリューションが用意されています。
ショ糖が増加額各ソリューションはより集中され、したがって、先行するものより高密度で追加されます。ソリューションの正確な密度は生物により異なるが、分離するコンポーネントによって異なります。ソリューションの最後の解決策、試料の密度のコンポーネントよりも高密度に分離するコンポーネント間の密度が必要です。アプリケーションでスクロース、核酸のようなより高密度のコンポーネントを分離するためのテクニックを説明します。
きれいな遠心管にはショ糖密度勾配が作成されました。ピペットを使用最も濃縮されたショ糖溶液を描画します。握られた直立物管、ピペット チップを壁の高置かれ、液体調剤着実にダウン。作業領域は、振動および他の妨害を置かないことが重要です。
先端を交換した後残りの解決策は、密度の高い順に追加されます。彼らは独立した層を形成し、混合を避けるために慎重に分配されます。最後に、細胞のサンプルの約 30 ミリリットルがグラデーションの上に追加され、チューブの重量を量った。これはプロセスの次のステップ、重量配分のバランスをとるためです。
遠心分離をできるだけ早く開始する必要があります。チューブは、スロットに反対の等しい重量の空のソリューションを配置することによって、バランスの取れた、ローターに配置されます。ローターは、超遠心機、密封システムに配置されます。温度と回転速度と時間を設定します。典型的な値は、16 時間以上 100,000 × g の力で 4 ° C です。
遠心分離の後、チューブが、ローターから引き出される直立し、邪魔されずにそれを保つために世話します。携帯電話のさまざまなコンポーネントがソリューションのレイヤー間離散バンドに分画しました。分数は、注射器で収集できます。または、チューブの底部は罰金、滅菌針でパンクすることができ、生殖不能の管に流出収集します。細胞成分が分離されました。-80 ° C で保存することができます。
今では基本的な手順を見てきた、いくつかのアプリケーションを見てみましょう。
典型的なアプリケーションは、植物細胞における多蛋白質複合体の分離です。この例では責任循環的電子伝達複合体はチラコイド、光合成における光反応のサイトから分離されているが。この手順は、14 から 45% ショ糖のディスクリートのソリューションを使用します。遠心分離発生 4 ° C で 14 時間以上 100,000 × g
核酸はショ糖より高密度なので密度遠心分離できないからそれらを分離細胞小器官非破壊的。
「率ゾーナル遠心分離」として知られている別の手法が使用されます。細胞小器官の密度だけでなくその構造にも依存している彼らの沈降率に基づいて分離します。連続的な勾配を使用して、このプロパティに基づいてコンポーネントを分離します。
手続きの手順は、それらの密度の場合に似ています。この例では、分離 RNA リボソーム複合体共沈殿を防ぐために、数時間後中断が連続的な勾配の 5% から 20%、230,000 x g の遠心分離に遠心分離を使用します。
核酸鎖は、密度に基づいて互いから分離することができます。
これは、繊維豊富なグアニンとシトシン、アデニンとチアミン豊富でそれらより高密度ためにです。この場合、ショ糖、核酸よりも密度が低いために、ショ糖のグラデーションが確立できません。代わりに、彼らは十分な密度と低粘度を持っていると、通常 1.75 g/ml 1.65 からのセシウム塩化グラデーションが使用します。
ご覧のようにプランクトン DNA 連続セシウム塩化グラデーションを使用して精製されます。真空下で 18 時間以上 1,000,000 × g で遠心分離が発生します。
ショ糖密度勾配遠心でゼウスのビデオを見てきただけ。今密度勾配のしくみ、ステップ グラデーションの作成方法およびロードし、超遠心機を操作する方法を理解する必要があります。見てくれてありがとう!
Procedure
Disclosures
Transcript
Density gradient ultracentrifugation is a common approach to isolate and purify cell structures for biochemical experiments. The technique uses a high-speed, or ultra, centrifuge to nondestructively separate cellular components in a density gradient. This video describes the principles of density gradient ultracentrifugation, provides a general procedure using a sucrose gradient, and discusses some applications.
Let’s start by examining the principles of ultracentrifuges and density gradients. A suspension contains particles in a liquid solvent. Because of gravity, particles denser than the solvent sediment out while those less dense than the solvent float. The greater the difference in density between the particle and the solvent, the faster the separation.
An ultracentrifuge contains a unit called a rotor, which rotates at highly controlled speeds, simulating a strong gravitational field. Within this field, the differences in density between particles and the solvent are magnified.
The strength of the field depends on the speed of rotation. Even a small rotor at a relatively low rotational speed can create a force thousands of times stronger than the earth’s gravitational field.
If a tube contains several liquids of different densities, centrifugation will keep them in separate layers in order of density, with the densest liquid closest to the base. Such a layering of multiple liquids is called a “density gradient.” There are two types. In step gradients, liquids of decreasing density are carefully layered on top one another. In continuous gradients, the liquids are mixed in varying proportions, so the density decreases smoothly from the base upwards.
Cellular organelles can be separated using a step gradient, through “isopycnic density-gradient centrifugation.” This is the simplest and most common centrifugation procedure.
This procedure is used to separate the cellular structures. The more dense the organelle, the further it descends-with mitochondria at the top and nucleic acids towards the bottom.
Now that you know the principles behind the technique, let’s see it in the lab.
Before the procedure is started, the manufacturer’s speed and density ratings should be noted, and the ultracentrifuge checked for corrosion. This procedure uses a swinging-bucket rotor.
First, the cellular material is prepared by homogenizing the cells, which nondestructively releases their organelles. The homogenate may be fractionated through preliminary low-speed centrifugation, to remove low-density components. Next, the sucrose solutions are prepared.
Sucrose is added in increasing amounts so each solution is more concentrated, and therefore denser, than the preceding one. The exact densities of the solutions will depend on the components to be separated, which vary between organisms. The solutions should have densities between those of the components to be separated, with the last solution denser than the densest component of the analyte. Techniques for separating components denser than sucrose, like nucleic acids, are described in the applications.
The sucrose gradient is now created in a clean centrifuge tube. A pipette is used to draw up the most concentrated sucrose solution. With the tube held upright, the pipette tip is placed high against the wall, and the liquid dispensed steadily down. It’s important that the working area is kept free of vibrations and other disturbances.
After replacing the tip, the remaining solutions are added in order of decreasing density. They are dispensed carefully to form distinct layers and avoid mixing. Finally, about half a milliliter of the cellular sample is added atop the gradient, and the tube is weighed. This is used to balance the weight distribution, the next step of the process.
Centrifugation should begin as soon as possible. The tube is placed in the rotor, which is then balanced by placing blank solutions of equal weight in opposing slots. The rotor is placed in the ultracentrifuge and the system sealed. The temperature and rotation speed and time are set. Typical values are 4 °C with a force of over 100,000 x g for 16 h.
After centrifugation, the tube is withdrawn from the rotor, taking care to keep it upright and undisturbed. The different cellular components have fractionated into discrete bands between the solution layers. The fractions can be collected with a syringe. Alternately, the bottom of the tube can be punctured with a fine, sterilized needle and the outflow collected in sterile tubes. The cellular components have now been isolated. They can be stored at -80 °C.
Now that we’ve seen the basic procedure, let’s look at some applications.
A typical application is the isolation of multi-protein complexes in plant cells. In this example, complexes responsible for cyclic electron flow are being isolated from the thylakoid, the site of the light reaction in photosynthesis. This procedure uses discrete solutions of 14 to 45% sucrose. Centrifugation occurs over 100,000 x g for 14 h at 4 °C.
Because nucleic acids are denser than sucrose, isopycnic centrifugation cannot separate them from organelles nondestructively.
A different technique, known as “rate-zonal centrifugation” is used. It separates organelles based on their sedimentation rates, which depend not only on their densities, but also on their conformations. A continuous gradient is used to separate the components based on this property.
The procedural steps are similar to those for isopycnic cases. In this example, RNA-ribosome complexes are isolated using a continuous gradient of 5% to 20%, centrifuged at 230,000 x g. Centrifugation is interrupted after a few hours to prevent co-precipitation.
Nucleic acid strands can be separated from each other on the basis of density.
This is because strands rich in guanine and cytosine are denser than those rich in adenine and thiamine. In this case, the gradient cannot be made of sucrose, because sucrose is less dense than nucleic acids. Instead, cesium chloride gradients, typically from 1.65 to 1.75 g/mL are used, as they have sufficient density and a low viscosity.
Here we see plankton DNA being purified using a continuous cesium chloride gradient. Centrifugation occurs at over 1,000,000 x g for 18 h under vacuum.
You’ve just watched JoVE’s video on ultracentrifugation with a sucrose density gradient. You should now understand how a density gradient works, how to construct a step gradient, and how to load and operate an ultracentrifuge. Thanks for watching!
