Overview
代謝ラベリングを使用して、生化学的変換とセルに発生する変更をプローブします。自然の生体分子の構造を模倣する化学類縁体を使用して、これは。セルは、類縁体の内因性の生化学的プロセスは、ラベル付けされている化合物を生産を利用します。ラベル検出および親和性の札は、SDS-PAGE や NMR などの他の生化学的分析手法を用いた代謝経路を解明するために使用することができることができます。
このビデオは、代謝ラベリングとショー 2 つの一般的な手順の概念を紹介します。 最初は、同位体標識を使用して蛋白質のリン酸化の特徴します。2 番目のカバー代謝ラベリングのも 3 つのアプリケーション内でのタンパク質間相互作用を特徴付けるための光反応性ラベリング表示されます: 植物素材をラベル付け、分類の速度を測定するための RNA および初期胚の糖鎖をラベリングします。
代謝ラベリングを使用して、セルの機械を調査します。これは生化学的変換と発生する変更をプローブする化学類縁体を使って実現されます。このビデオは、同位体およびプロシージャ、およびいくつかのアプリケーションをラベリング光反応性代謝ラベリング、一般的な原則が表示されます。
代謝ラベリングは、さまざまな方法を使用して実施できます。ここで同位体、光反応性、およびバイオ直交のラベル付けについて説明します。
自然相手のこと化学的に同一構造の類似を使用して実行は同位体標識しますですが、珍しい同位体組み込まれている構造。この L-リジン アナログ炭素・窒素原子、炭素 13、窒素 15 に置き換えられます。同位体の類縁体の存在下で培養した細胞は、その生化学的構造にそれらを組み込む予定します。代謝産物は細胞から収集および分析のための精製します。安定同位体のサンプルを分析するには、質量分析法や核磁気共鳴分光法などの技術を使用しています。放射性ラベルとサンプル同位体ラベリング プロトコルで示される液体のシンチレーション カウントと x 線フィルムを用いています。
光反応性ラベルは、紫外線にさらされるまで安定なタンパク質に組み込む機能グループです。機能グループは、最も近い蛋白質に結合する反応性官能基を形成します。一般的な例では、L-写真-ロイシン, 光反応性架橋剤の光反応基ジアジリン リングが含まれています。同位体ラベリングと対照をなして光反応性化学類縁体と自然相手のいくつかの化学類似があります。細胞は優先的に類縁体の天然化合物を組み込むことができます。したがって、模倣されている化合物の中で光反応性ラベリングを行うことが重要です。紫外線にさらされ、一度分類された蛋白質の光反応性グループ不安定になり、反応性の高いタンパク質の複雑な作成の原因に相互作用の蛋白質と相互リンク。架橋複合体は、SDS-PAGE と質量分析法を使用して、分析することができますスナップショットとして機能します。これはどんな反応が反応種を識別することによって代謝経路で発生しているし、の結合部位を決定することでやり取りする方法に洞察力を提供します。
Bioorthogonal ラベリング戦略は、自然な生体分子がほとんどない反応性を持つ小型の官能基を持つ類縁体を利用します。たとえば、アザイドと言われてその反応の生化学的反応に直交する、小規模の機能グループです。シュタウディンガー結紮のホスフィン グループのアジドフェニル グループを攻撃します。これは近くのエステル、アミン結合リガンドの結果と分子反応遷移状態を得られます。Bioorthogonal 機能グループ分子に組み込まれては蛍光官能など検出タグで結紮することができ、親和性抗原などタグします。
いくつかの概念および新陳代謝の戦略が議論されている今、研究室では、プロセスを見てみましょう。
代謝標識実験の最初のステップは興味の蛋白質を集めることです。これを行うには、セル、プレート、育つ、表現方法は目的タンパク質の合成を促進するために使用されます。この例では、ロイシン豊富な繰り返しキナーゼまたはニラで表現されます。リン酸、放射性リン-32 を含む、アナログとして使用されます。電離放射線に対する保護するために適切な対策が必要です。これには、作業領域の設定、適切な保護具を身に着けている、放射能汚染のチェックが含まれます。安全対策が実行されると、同位体の類縁化合物を含む培地が用意しています。文化からメディアを削除、1 つを含む同位体化学類縁体に置き換えされ、培養します。次の培養細胞が分離します。ライセートの収集し、精製します。
浄化後、蛋白質は SDS ページを使用し、PVDF 膜に転送が解決されます。オートラジオグラフィーは、フィルムを x 線に膜を公開することによってされるので、蛍光イメージャを使用して測定します。西部にしみが付くこと、PVDF 膜のタンパク質の相対レベルを測定するために使用されます。この例ではロイシン豊富なリン酸化レベルは、キナーゼは、293 t 細胞を測定した合成を繰り返します。どのくらいリン ゲノムスキャニング ショーは、蛋白質に組み込まれました。ニラの蛋白質のレベルを解明西部にしみが付くこと。画像解析ソフトを使用して、蛋白質のリン酸化レベルの定量的なデータを取得します。
この次の手順では、光反応性のラベルに示します。最初に、セルを準備して培養します。光反応性アナログ中間ログ段階でセルに追加し、培養します。この手順では、p benzoylphenylalanine が使用されます。サンプル間隔で収集、氷の上に置きます。サンプルは、時間の経過とともに生化学プロセスのスナップショットを取得する公開されます。興味の蛋白質は、精製し、SDS-PAGE を使用して解決します。
光反応性ラベリング戦略は興味の蛋白質と相互作用する化合物を識別するために使用されました。ウエスタンブロット高分子量蛋白質を示すショー タンパク質バンドとバイオアセッテイ照射試料に存在しています。これら紫外線照射時に発生する蛋白質蛋白質の相互作用により架橋からです。
代謝ラベリング手順を確認しましたところ、今、いくつかのプロセスを使用する方法を見てみましょう。
代謝ラベリングの概念は、多細胞生物に拡張できます。植物は作り出されたラベルの付いた植物材料に安定同位体の豊富な密封された環境で育ちます。炭素 13 を含んでいる炭酸ガスは、窒素 15 の豊富な肥料を使用しながら、筐体に追加されます。結果収穫された植物材料は炭素・窒素循環の生態系からの質問に答えることができます。
ラベルは、古い RNA から新たに合成された RNA を分離をできます。アナログの初期濃度を変更すると、新しい RNA 合成の速度を決定できます。結果は、4 thiouridine の濃度がどのくらい新しい RNA の転写に影響を示します。さらに、分光光度計で直接 RNA にラベルの混入率を定量化することができます。
双直交クリックケミストリーを用いたゼブラフィッシュ胚の糖鎖がラベル付けできます。卵は、糖のアルキン ラベルでラベリング化合物が注入されます。幼虫の糖鎖が次に縛られる色素化合物に必要な開発段階で。胚の糖鎖はイメージします。異なる時点で生成される糖鎖は、胚の開発のさまざまな段階でさまざまな色を使用したラベリングによって識別できます。
代謝ラベリング ゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオ代謝ラベリングの概念と戦略を説明、2 つの一般的な手順を行って、技術の用途のいくつかをカバーします。
見てくれてありがとう!
Procedure
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
