Overview
O ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) é um procedimento bioquímico usado para elucidar a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos. Neste ensaio, um ácido nucleico radiolabeled e proteína de teste são misturados. A vinculação é determinada através da eletroforese gel que separa os componentes com base na massa, carga e conformação.
Este vídeo mostra os conceitos da EMSA e um procedimento geral, incluindo preparação de gel e proteína, ligação, eletroforese e detecção. Os aplicativos abordados neste vídeo incluem a análise de enzimas de remodelação de cromatina, uma EMSA modificada que incorpora biontinylation e o estudo de locais de ligação de reguladores de resposta bacteriana.
EMSA, o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, também conhecido como ensaio de mudança de gel, é um procedimento bioquímico versátil e sensível. A EMSA elucida a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos detectando uma mudança nas bandas em eletroforese de gel.
Este vídeo descreve os princípios da EMSA, fornece um procedimento geral e discute alguns aplicativos.
Replicação, transcrição e reparo de DNA, bem como processamento de RNA são todos processos bioquímicos críticos. Todos envolvem a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos. Muitas doenças e transtornos graves estão associados a modificações nessa ligação. A EMSA é uma técnica para determinar qualitativamente se uma proteína específica se liga a um ácido nucleico específico. Primeiro, o ácido nucleico é rotulado, geralmente com fósforo radioativo-32, para criar uma sonda. Em seguida, a proteína de teste e a sonda de ácido nucleico são misturados. Quando uma proteína se liga a uma sonda de ácido nucleico, o complexo resultante tem maior massa e uma conformação diferente do ácido nucleico sozinho.
Uma vez ligados, os complexos são analisados com eletroforese gel. Nesta técnica, um campo elétrico força macromoléculas a migrar através de uma matriz de gel. Os componentes se separam com base na massa, carga e conformação. A eletroforese pode separar complexos de DNA de proteínas de sondas não ligadas. Como possuem diferentes massas e conformações, migrarão através do gel a taxas diferentes e se separarão. A separação é facilmente detectada, graças à presença do fósforo radioativo, e prova que a proteína se liga com sucesso ao ácido nucleico dado. Para verificar a identificação da proteína, um "ensaio supershift" usa um anticorpo com uma afinidade conhecida com a proteína. Isso tem o benefício adicional de mudar ainda mais a resolução complexa e crescente.
Agora que vimos os princípios, vamos ver no laboratório.
Para iniciar o procedimento, a proteína deve ser isolada. Para isso, as técnicas de biologia molecular são usadas para expressar a proteína nas células e, em seguida, purificar.
O ácido nucleico é amplificado e rotulado para criar uma sonda. A rotulagem é feita através de incubação por 10 min com dCTP contendo fósforo radioativo-32. Uma bancada de trabalho segura para radiação e equipamentos de proteção são necessários.
O gel é então preparado. O gel precisa ser não desnaturado, para evitar que a proteína altere a conformação e potencialmente desvincular da sonda durante a eletroforese. Os géis de poliacrilamida têm tamanhos de poros de 5 a 20 nm e são úteis para sondas curtas de até 100 pares de base de comprimento. Os géis agarose têm tamanhos de poros de 70-700 nm e são úteis para sondas maiores.
Com a sonda de proteína e ácido nucleico agora preparada, passamos a nos ligar. Uma solução tampão TRIS é preparada e a proteína e a sonda são adicionadas. O pH deve ser semelhante às condições fisiológicas, e concentração de sal suficiente para evitar que a proteína forme ligações fracas com ácidos nucleicos não-alvo. A reação prossegue por 20-30 min a 4 °C.
O próximo passo é a eletroforese. Um buffer de baixa resistência iônica e um pH semelhante ao usado na reação de ligação é utilizado. Ele produz um "efeito de caging" que estabiliza complexos, aumenta a mobilidade e reduz a geração de calor. Após a eletroforese, os componentes do gel são transferidos para o papel filtro. Em uma sala escura, o papel filtro é então exposto ao filme. Se a proteína se ligar à sonda, duas regiões distintas rotuladas serão visíveis na transferência. Um representando o complexo, e um separado representando a sonda desvinculada. A separação demonstra que a proteína está ligada com sucesso ao ácido nucleico.
Agora que vimos o procedimento básico, vamos ver algumas aplicações.
Cromatina é o complexo bem embalado de DNA e proteínas encontradas células eucarióticas. Enzimas remodelantes de cromatinas modificam a estrutura para abrir o DNA para transcrição. À medida que isso muda a mobilidade do complexo, a EMSA pode ser usada para explorar a atividade de ligação da enzima.
Uma abordagem alternativa à rotulagem aproveita a interação entre o DNA e a enzima metiltransferase. Um cofator pode ser modificado para se ligar permanentemente ao DNA via metiltransferase. Em vez de rotular com fósforo-32, o cofator é conjugado à biotina, o que é vantajoso porque não é radioativo. Como o cofato é específico do local em seu anexo, é relevante para genotipagem, detecção de metilação e entrega de genes. Os ácidos nucleicos biotinilatados são detectados através da fluorescência ultravioleta.
Quando os estímulos ambientais ativam as quinases histidinas, um "regulador de resposta" é fosfoilado. Isso, por sua vez, se liga ao DNA, afetando a transcrição, que pode ser estudada pela EMSA. Por exemplo, um regulador de resposta em Desulfovibrio vulgaris foi demonstrado para se ligar ao gene de interesse. A EMSA foi usada para verificar se a ligação ocorreu.
Você acabou de ver o vídeo de JoVE no ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Você deve agora entender seus princípios de operação, os passos em seu procedimento, e seus principais parâmetros operacionais.
Obrigado por assistir!
Procedure
O ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) é um procedimento bioquímico usado para elucidar a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos. Neste ensaio, um ácido nucleico radiolabeled e proteína de teste são misturados. A vinculação é determinada através da eletroforese gel que separa os componentes com base na massa, carga e conformação.
Este vídeo mostra os conceitos da EMSA e um procedimento geral, incluindo preparação de gel e proteína, ligação, eletroforese e detecção. Os aplicativos abordados neste vídeo incluem a análise de enzimas de remodelação de cromatina, uma EMSA modificada que incorpora biontinylation e o estudo de locais de ligação de reguladores de resposta bacteriana.
EMSA, o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, também conhecido como ensaio de mudança de gel, é um procedimento bioquímico versátil e sensível. A EMSA elucida a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos detectando uma mudança nas bandas em eletroforese de gel.
Este vídeo descreve os princípios da EMSA, fornece um procedimento geral e discute alguns aplicativos.
Replicação, transcrição e reparo de DNA, bem como processamento de RNA são todos processos bioquímicos críticos. Todos envolvem a ligação entre proteínas e ácidos nucleicos. Muitas doenças e transtornos graves estão associados a modificações nessa ligação. A EMSA é uma técnica para determinar qualitativamente se uma proteína específica se liga a um ácido nucleico específico. Primeiro, o ácido nucleico é rotulado, geralmente com fósforo radioativo-32, para criar uma sonda. Em seguida, a proteína de teste e a sonda de ácido nucleico são misturados. Quando uma proteína se liga a uma sonda de ácido nucleico, o complexo resultante tem maior massa e uma conformação diferente do ácido nucleico sozinho.
Uma vez ligados, os complexos são analisados com eletroforese gel. Nesta técnica, um campo elétrico força macromoléculas a migrar através de uma matriz de gel. Os componentes se separam com base na massa, carga e conformação. A eletroforese pode separar complexos de DNA de proteínas de sondas não ligadas. Como possuem diferentes massas e conformações, migrarão através do gel a taxas diferentes e se separarão. A separação é facilmente detectada, graças à presença do fósforo radioativo, e prova que a proteína se liga com sucesso ao ácido nucleico dado. Para verificar a identificação da proteína, um "ensaio supershift" usa um anticorpo com uma afinidade conhecida com a proteína. Isso tem o benefício adicional de mudar ainda mais a resolução complexa e crescente.
Agora que vimos os princípios, vamos ver no laboratório.
Para iniciar o procedimento, a proteína deve ser isolada. Para isso, as técnicas de biologia molecular são usadas para expressar a proteína nas células e, em seguida, purificar.
O ácido nucleico é amplificado e rotulado para criar uma sonda. A rotulagem é feita através de incubação por 10 min com dCTP contendo fósforo radioativo-32. Uma bancada de trabalho segura para radiação e equipamentos de proteção são necessários.
O gel é então preparado. O gel precisa ser não desnaturado, para evitar que a proteína altere a conformação e potencialmente desvincular da sonda durante a eletroforese. Os géis de poliacrilamida têm tamanhos de poros de 5 a 20 nm e são úteis para sondas curtas de até 100 pares de base de comprimento. Os géis agarose têm tamanhos de poros de 70-700 nm e são úteis para sondas maiores.
Com a sonda de proteína e ácido nucleico agora preparada, passamos a nos ligar. Uma solução tampão TRIS é preparada e a proteína e a sonda são adicionadas. O pH deve ser semelhante às condições fisiológicas, e concentração de sal suficiente para evitar que a proteína forme ligações fracas com ácidos nucleicos não-alvo. A reação prossegue por 20-30 min a 4 °C.
O próximo passo é a eletroforese. Um buffer de baixa resistência iônica e um pH semelhante ao usado na reação de ligação é utilizado. Ele produz um "efeito de caging" que estabiliza complexos, aumenta a mobilidade e reduz a geração de calor. Após a eletroforese, os componentes do gel são transferidos para o papel filtro. Em uma sala escura, o papel filtro é então exposto ao filme. Se a proteína se ligar à sonda, duas regiões distintas rotuladas serão visíveis na transferência. Um representando o complexo, e um separado representando a sonda desvinculada. A separação demonstra que a proteína está ligada com sucesso ao ácido nucleico.
Agora que vimos o procedimento básico, vamos ver algumas aplicações.
Cromatina é o complexo bem embalado de DNA e proteínas encontradas células eucarióticas. Enzimas remodelantes de cromatinas modificam a estrutura para abrir o DNA para transcrição. À medida que isso muda a mobilidade do complexo, a EMSA pode ser usada para explorar a atividade de ligação da enzima.
Uma abordagem alternativa à rotulagem aproveita a interação entre o DNA e a enzima metiltransferase. Um cofator pode ser modificado para se ligar permanentemente ao DNA via metiltransferase. Em vez de rotular com fósforo-32, o cofator é conjugado à biotina, o que é vantajoso porque não é radioativo. Como o cofato é específico do local em seu anexo, é relevante para genotipagem, detecção de metilação e entrega de genes. Os ácidos nucleicos biotinilatados são detectados através da fluorescência ultravioleta.
Quando os estímulos ambientais ativam as quinases histidinas, um "regulador de resposta" é fosfoilado. Isso, por sua vez, se liga ao DNA, afetando a transcrição, que pode ser estudada pela EMSA. Por exemplo, um regulador de resposta em Desulfovibrio vulgaris foi demonstrado para se ligar ao gene de interesse. A EMSA foi usada para verificar se a ligação ocorreu.
Você acabou de ver o vídeo de JoVE no ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Você deve agora entender seus princípios de operação, os passos em seu procedimento, e seus principais parâmetros operacionais.
Obrigado por assistir!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
