Colture cellulari primarie dall'epitelio retinico del pigmento del Mouse

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un modo fattibile per ottenere cellule di epitelio pigmentato retinico da occhi di topo e per coltivarle in vitro mantenendo le loro proprietà originali. Questo metodo aiuterà i ricercatori di RPE a ottenere le competenze di dissezione necessarie per stabilire colture cellulari di RPE di topo e a dimostrare come farlo in modo semplice. Il vantaggio principale di questa procedura è che è semplice e fattibile.

L'unica cosa richiesta è la pratica, e la dimostrazione visiva dell'isolamento RPE e la microscopia dimostrano letteralmente come ottenere le competenze richieste. Per isolare i bulbi oculari del topo, prima sopprimere due topi utilizzando qualsiasi metodo approvato e, indossando i guanti, posizionarlo su un tampone assorbente. Posiziona il pollice e l'indice intorno all'occhio e spingi delicatamente la pelle per sporgere il bulbo oculare.

Una volta che il bulbo oculare è sporgente, infila la punta di un paio di forbici angolate tra la pelle e il bulbo oculare e taglia con cura il tessuto intorno all'occhio fino a quando non viene rilasciato. Quindi, immergere brevemente l'occhio isolato nell'etanolo al 70% e immergerlo in PBS in una capsula di Petri. Dopo aver raccolto entrambi gli occhi da ciascuno dei topi, procedere con la dissezione.

Al microscopio da dissezione, rimuovere con cura la maggior parte del tessuto connettivo intorno all'occhio. Non è necessario tenere l'occhio immerso durante questo passaggio. Per fare ciò, usa una pinza da sutura per sollevare i tessuti connettivi dal bulbo oculare e tagliali usando le forbici Vannas.

Non tagliare la sclera perché è praticamente impossibile ottenere le conchiglie oculari posteriori intatte se la sclera viene tagliata. Dopo aver pulito il tessuto connettivo, immergere i bulbi oculari in PBS e passare a lavorare in una cabina a flusso laminare in condizioni sterili. Ora, usa una pinza per trasferire gli occhi in un piatto di DMEM caldo contenente un'alta concentrazione di glucosio.

Dopo 20-30 secondi, sostituire la soluzione di lavaggio utilizzando l'aspirazione per un secondo lavaggio. Trasferire i bulbi oculari nella soluzione di lavoro riscaldata al 2% di Dispasi II in provette da 15 ml e lasciare incubare gli occhi a 37 gradi Celsius per 45 minuti per dissociarsi. Dopo l'incubazione, i bulbi oculari dovrebbero essere morbidi.

Quindi, lava gli occhi due volte nello stesso recipiente con un terreno di coltura riscaldato. Dopo il secondo lavaggio, sostituire il terreno di coltura con un terreno fresco e trasferire i bulbi oculari e il terreno in un nuovo piatto per continuare la dissezione. Continuare a lavorare su un banco pulito con l'aiuto di un microscopio da dissezione.

Inizia la dissezione fissando l'occhio con una pinza e fai un'incisione intorno all'ora serrata usando le forbici Vannas. Mantenendo il bulbo oculare nella soluzione, rimuovere con cura la cornea anteriore estendendo il taglio attorno alla circonferenza dell'ora serrata. Dopo aver completato il taglio, estrarre la cornea anteriore.

Quindi, rimuovere la capsula del cristallino e l'epitelio pigmentato dell'iride associato estraendolo delicatamente dalla conchiglia oculare utilizzando una pinza dentata. Quindi, ripetere la dissezione sugli occhi rimanenti e incubare le conchiglie oculari posteriori in terreno di crescita per 20 minuti a 37 gradi Celsius per facilitare la separazione della retina neurale dall'EPR. Dopo 20 minuti, tagliare le conchiglie oculari posteriori in quattro petali.

Fai i tagli abbastanza lunghi da appiattire l'oculare, ma abbastanza corti da mantenere i petali collegati. Quindi, appiattisci l'oculare per rimuovere la retina neurale. Fissare il restante complesso della sclera coroide RPE con la mano non dominante e tirare via molto delicatamente la retina dai bordi.

Una volta rimossa la retina neurale, trasferire il complesso della sclera coroide RPE in quarti in un nuovo piatto di coltura sterile riempito con terreno di coltura caldo. Nella capsula di Petri, fissare un petalo del complesso della sclera coroide RPE squartata con una pinza super fine e, utilizzando un coltello a mezzaluna microchirurgico, staccare delicatamente i fogli intatti di RPE dalla membrana basale sottostante. L'RPE brunastro dovrebbe essere chiaramente distinguibile dalla coroide scura, appiccicosa e soffice.

Quindi, bagnare un puntale per micropipetta p200 con terreno di coltura e utilizzare il puntale per trasferire i fogli RPE nel nuovo piatto contenente il terreno di crescita riscaldato. Ora, lava i fogli RPE tre volte in un terreno di coltura riscaldato. Dopo ogni fase di lavaggio, raccogliere con cura i fogli di RPE evitando altri tessuti, come i detriti della retina o della coroide.

Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i fogli di RPE in una provetta da 1,5 ml e lasciarli sedimentare per gravità. Quindi, nella cappa a flusso laminare rimuovere il terreno di coltura in eccesso e risospendere le cellule in un terreno di crescita caldo appena fatto. Ora, triturare delicatamente il tessuto utilizzando una micropipetta p200 senza formare bolle.

Triturare tra le 40 e le 50 volte, quanto basta per ottenere una sospensione a cella singola. Fai attenzione perché troppa triturazione può essere letale. Ora, piastrate le cellule RPE raccolte da entrambi i topi in un inserto di membrana in poliestere da 12 mL nel pozzetto di una piastra di coltura da 12 pozzetti.

Si desidera un'elevata densità cellulare in modo che le cellule RPE mantengano la loro forma esagonale e la pigmentazione. Una coltura primaria di RPE di topo stabilita da due topi in un inserto di membrana in poliestere da 12 mm ha raggiunto una confluenza del 90-95% dopo una settimana di coltura. Dopo due settimane di coltura, le cellule erano confluenti al 100% e hanno iniziato a formare un mosaico di cellule esagonali pigmentate e binucleate.

Entro la terza settimana, le cellule continuavano a cambiare forma e pigmentazione. Tuttavia, dopo quattro settimane una parte delle cellule è diventata iperpigmentata. La purezza della coltura cellulare primaria di RPE è stata valutata utilizzando l'anticorpo RPE65, che marca, l'isomeroidralasi, un enzima fondamentale per il ciclo visivo dei vertebrati.

L'integrità delle giunzioni cellula-cellula e la forma esagonale della cellula sono state dimostrate mediante colorazione con falloidina. Le giunzioni strette sono state visualizzate mediante analisi dell'espressione della proteina ZO-1, che ha potuto essere visualizzata utilizzando un colorante amminico e convalidata mediante western blotting. Nel complesso, le colture sono in grado di proliferare, mantenere la pigmentazione e la loro forma esagonale, formando giunzioni strette ed esprimendo marcatori funzionali, come RPE65.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule RPE dagli occhi del topo e coltivarle correttamente in vitro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di tenere sempre gli occhi umidi e cercare di operare il più velocemente possibile.