Digestão de proteínas, ultrafiltração e cromatografia de exclusão para otimizar o isolamento do Exosomes do Plasma de sangue humano e soro

O objetivo geral deste procedimento é purificar as vesículas do sangue enquanto reduz as proteínas e complexos co-purificadores que podem interferir na análise a jusante, incluindo rastreamento de nanopartículas e proteômica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave, como quais são as alterações proteômicas nas vesículas séricas ou plasmáticas durante o estado da doença em comparação com um estado saudável. A principal vantagem dessa técnica é o aumento da precisão na enumeração de vesículas.

Ao remover contaminantes abundantes não vesículas, aumentamos a identificação de proteínas de baixa abundância e os potenciais biomarcadores de doenças. A implicação desse método se estende à descoberta de novos biomarcadores diagnósticos. Permite uma determinação mais precisa da composição proteômica de vesículas extracelulares em matrizes complexas, como o sangue.

Geralmente, os indivíduos novos na purificação de vesículas terão dificuldades porque existem muitas técnicas publicadas. A reprodutibilidade da análise proteômica a jusante é afetada pela co-purificação de proteínas séricas abundantes. Equilibre uma amostra de soro ou plasma colocando o tubo em condições sem agitação em um refrigerador de quatro graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, alíquota de 250 microlitros da amostra em um tubo de microcentrífuga usando uma pipeta de 1.000 microlitros. Centrifugar a amostra a 18 000 vezes G durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Usando uma pipeta de 200 microlitros, remova 200 microlitros do sobrenadante limpo e adicione-o a um novo tubo de microcentrífuga.

Evite qualquer material peletizado durante a transferência do sobrenadante. Quantificar o teor proteico da amostra por ensaio de BCA utilizando o protocolo do fabricante. Para realizar o ensaio, dilua a amostra de um a 50 em uma solução salina tamponada com fosfato X.

Teste cada amostra em duplicata. Preparar uma solução de proteinase K a uma concentração de 50 microgramas por mililitro em PBS, adicionando primeiro a quantidade correspondente de proteinase K a um tubo cónico. Em seguida, adicione o tampão e o vórtice por 30 segundos três vezes em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de proteinase K à alíquota de amostra de 10 miligramas e misture delicadamente pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta de 200 microlitros. Incube a amostra a 37 graus Celsius em banho-maria por 30 minutos, colocando o tubo em um suporte de tubo flutuante. Para evitar possíveis vazamentos, evite a imersão completa do tubo no banho-maria.

Após a incubação, transfira a amostra e o rack para um banho-maria a 60 graus Celsius por 10 minutos para inativar a proteinase K. Em seguida, enxágue um dispositivo de ultrafiltração contendo um filtro de corte de peso molecular de 100 kilodalton com PBS antes de usar. Use uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar 500 microlitros de PBS ao filtro. Depois de girar o dispositivo a 3.700 vezes G por cinco minutos, descarte qualquer retentado restante, bem como o eluído.

Aumente o volume da amostra para 500 microlitros adicionando PBS. Em seguida, pipetar a amostra para o dispositivo de ultrafiltração pré-enxaguado. Centrifugar o dispositivo de ultrafiltração numa centrífuga de bancada de ângulo fixo a 3 700 vezes G e a quatro graus Celsius até que a amostra tenha reduzido a um volume de 50 microlitros.

Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS diretamente na membrana do filtro. E pipete para cima e para baixo cinco vezes antes de centrifugar novamente como antes. Transfira o retentado final de 50 microlitros para um novo tubo de microcentrífuga.

Enxágue a membrana do filtro com 200 microlitros de PBS, pipetando para cima e para baixo 10 vezes. E transfira a lavagem para o tubo. Em seguida, coloque o porta-filtro na posição inversa em um novo tubo.

Execute uma recuperação de rotação reversa por cinco minutos a 2.000 vezes G para recuperar a amostra restante da membrana. Coloque as colunas em um rack de tamanho apropriado. Adicione 850 microlitros de pasta SEC com grânulos com um corte de peso molecular de 700 kilodaltons usando uma pipeta de 1.000 microlitros.

Destampe a parte inferior da coluna e deixe o líquido escorrer para um recipiente de resíduos por cinco minutos. Depois de drenado, adicione 10 microlitros de PBS para lavar a resina. Aguarde 20 minutos para que a lavagem escorra da coluna.

Colocar a amostra tratada com proteinase K concentrada num tubo cónico de 15 mililitros. E aumente o volume da amostra para cinco mililitros adicionando PBS com uma pipeta sorológica. Misture o tubo suavemente balançando por um minuto.

Em seguida, aplique lentamente a amostra na coluna preparada com uma pipeta sorológica. Recolher o fluxo num novo tubo cónico de 15 ml. Pipetar novamente o material recolhido sobre a resina para remover o material remanescente abaixo de 700 quilodaltons, recolhendo o fluxo num novo tubo cónico de 15 mililitros.

Lave a resina duas vezes adicionando um mililitro de PBS de cada vez. Colete o fluxo em um tubo. O volume final total será de aproximadamente sete mililitros.

Enxágue um dispositivo de ultrafiltração com um filtro de peso molecular de três quilodaltons, como antes. Centrifugue em um rotor de balde oscilante a 3.700 vezes G e quatro graus Celsius. O buffer passará pelo filtro e poderá ser descartado.

Os exossomos concentrados serão retidos acima do filtro. Centrifugue a amostra até que o volume acima do filtro seja reduzido para 200 microlitros. Quantificar o teor proteico da amostra por ensaio de BCA utilizando o protocolo do fabricante.

Adicione cinco microgramas de exossomos purificados a um mililitro de PBS. E vórtice por 15 segundos em velocidade média baixa. Coloque a amostra em uma seringa descartável de um mililitro.

Se disponível, coloque a seringa em um conjunto automático de bomba de seringa para injetar a amostra de exossomo diluída a uma taxa de 30 microlitros por minuto. Defina o script de análise para executar três replicações técnicas por um mínimo de 30 segundos usando um fluxo constante para cada replicação. Para a análise, defina o limite de captura em cinco.

Finalmente, determine a redução de proteína solúvel conforme descrito no protocolo de texto. São mostrados resultados representativos da análise de rastreamento de nanopartículas de vesículas de soro purificadas. O tamanho da vesícula é de aproximadamente 100 nanômetros, como esperado.

Aqui é mostrado um gel de proteína corado com Coomassie comparando o soro bruto, frações pré e pós SEC mostrando a redução no albúmen e outros contaminantes não vesiculares. Um Western blot exibe a retenção de CD63, uma proteína de exossomo característica após o tratamento e purificação da proteinase K. A etapa da proteinase K é projetada para digerir proteínas solúveis.

O CD63 é uma proteína transmembrana e menos suscetível à proteinase K na concentração e comprimento de incubação determinados. Aqui, um Western blot mostra a depleção de albumina, a proteína mais abundante no sangue e uma proteína co-purificadora comum após a purificação. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis horas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a ultrafiltração por centrífuga, digestão de protease e cromatografia de exclusão de tamanho para obter vesículas de fluidos biológicos. É importante realizar a quantificação de proteínas por BCA ou técnica equivalente antes de uma cromatografia e rastreamento de nanopartículas. Os resultados variam se as concentrações de proteína excederem as observadas neste protocolo.

Não se esqueça de que trabalhar com fluidos biológicos pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, incluindo luvas, jaleco e óculos de segurança, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento. Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massa por cromatografia líquida, podem ser realizados para determinar as proteínas exatas contidas nas vesículas purificadas. Embora esse método possa fornecer informações sobre a composição das vesículas sanguíneas, ele também pode ser aplicado a outros tipos de amostra, como urina, LCR ou sobrenadantes de cultura de células.