Profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle Candida albicans per analisi istologiche

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare l'attivazione del sistema immunitario durante le infezioni della pelle iniettando Candida albicans per preservare l'architettura della pelle e la localizzazione di specifiche cellule immunitarie e non immunitarie. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo immunologico come la natura e la localizzazione delle cellule immunitarie reclutate durante le infezioni cutanee e i principali mediatori coinvolti. Il vantaggio principale di questa tecnica è il mantenimento dell'architettura strutturale della pelle dopo l'iniezione fungina che ci permette di comprendere la localizzazione di ogni tipo di cellula immunitaria.

A dimostrare parte della procedura sarà Giulia Stamerra, dottoranda del laboratorio della professoressa Marina Vai. Per iniziare, inoculare il ceppo CAF3-1 di C.Albicans in provette contenenti un terreno ricco integrato con 50 milligrammi per litro di uridina e coltura a 25 gradi Celsius. In queste condizioni, il C.albicans cresce come lievito.

Monitorare la coltura utilizzando un analizzatore di contatori cellulari o uno spettrofotometro per misurare la concentrazione cellulare. Quando la coltura raggiunge otto volte 10 al sesto di cellule per millilitro, raccogliere il campione. Utilizzare il terreno di uridina YEPD con Hepes come agente tampone per risospendere le cellule e incubarle a 37 gradi Celsius per indurre la formazione di ife.

Dopo cinque ore di coltura, quando le ife dovrebbero essere visibili, al microscopio con ingrandimento 100X controllare la formazione delle ife. Coltura delle cellule per un totale di 16 ore, momento in cui il 95% della coltura avrà formato ife. Per arricchire ulteriormente la concentrazione di ife, centrifugare le aliquote della coltura a 3.300 volte g per cinque minuti.

Scartare il surnatante e utilizzare PBS sterile per risospendere il pellet a una concentrazione di una volta 10 per l'ottava ifa per millilitro. Dopo aver anestetizzato un topo rasato secondo il protocollo di testo, controlla il riflesso della zampa per assicurarti che l'animale sia profondamente sedato. Per iniettare le ife di C. albicans nel derma profondo, utilizzare due dita per tendere la pelle del fianco rasato, quindi inserire un ago da otto millimetri calibro 30 collegato a una siringa da insulina da 0,3 millilitri con un angolo da 10 a 15 gradi, con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto, e iniettare un volume finale di 50 microlitri corrispondente a cinque volte 10 alla sesta ifa.

Se l'angolo di iniezione è superiore a 15 gradi, l'agente patogeno verrà iniettato troppo in profondità nel derma, rischiando di danneggiare il peritoneo e, soprattutto, perdendo la possibilità di studiare le infezioni in modo specifico a livello cutaneo. A questo angolo, l'agente patogeno verrà iniettato a una profondità di circa 300-500 micron. Per assicurarsi che l'iniezione sia ben eseguita, verificare che il volume iniettato formi una protuberanza che viene assorbita dopo pochi minuti.

Per punti temporali inferiori a 24 ore, utilizzare un pennarello per contrassegnare l'area dell'infezione, poiché la protuberanza formata con l'iniezione persiste per alcuni minuti. Per i punti temporali di 24 ore o più tardi, questo passaggio non è richiesto, perché un'ulcera o una cisti saranno chiaramente visibili. Dopo l'eutanasia dei topi utilizzando le linee guida istituzionali, con una pinza chirurgica tirare la pelle al bordo del sito iniettato precedentemente segnato con il pennarello, quindi, utilizzando le forbici chirurgiche, asportare il sito infetto tagliando la pelle seguendo la linea segnata.

Immergere la pelle con il lato interno rivolto verso l'alto in uno stampo di base monouso riempito con composto O.C.T. Congelare il campione in azoto liquido fino a quando il composto diventa bianco. Non lasciare che l'azoto liquido copra il campione prima che sia completamente congelato, poiché ciò danneggerebbe il campione.

Per preparare i vetrini, partendo dal centro del campione tagliare il campione a metà per preparare le fette per l'istologia, quindi, utilizzando un criostato, tagliare fette spesse cinque micron. Utilizzare vetrini da microscopio caricati positivamente per raccogliere le fette. Per eseguire la colorazione H&E, immergere i vetrini nell'ematossilina di Gill per quattro minuti, quindi lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti.

Immergere i vetrini in una soluzione di eosina-Y per un minuto, lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per cinque minuti, quindi utilizzare acqua distillata per sciacquare i vetrini. Successivamente, disidratare i campioni immergendoli in una serie di etanolo per 15 secondi ciascuno. Per pulire i vetrini, trasferirli in un agente di pulizia istologica per almeno due minuti, quindi utilizzare il mezzo di montaggio e i vetrini coprioggetti per montare i campioni.

Utilizzare uno scanner per vetrini da microscopio con ingrandimento 40X per visualizzare i vetrini. Eseguire la colorazione con soluzione acida mestruale o PAS utilizzando acetone a temperatura ambiente per fissare i vetrini per un minuto, quindi utilizzare acqua corrente del rubinetto per lavare i vetrini per un minuto. Immergere i vetrini in PAS per cinque minuti, quindi utilizzare tre cambi di acqua distillata per lavare i campioni.

Quindi immergere i vetrini nel reagente di Schiff per 15 minuti, quindi utilizzare acqua corrente del rubinetto per lavare i vetrini per cinque minuti. Immergere il campione nell'ematossilina di Gill per cinque minuti per colorarli, quindi lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per 30 secondi. Disidratare i campioni mediante immersione in tre cambi di etanolo al 100% per 15 secondi ciascuno, quindi immergere i vetrini in un agente di pulizia istologica.

Con il mezzo di montaggio e i vetrini coprioggetto, montare i campioni eliminati, quindi utilizzare uno scanner per vetrini da microscopio per visualizzare i campioni. Dopo l'eutanasia dei topi e la rimozione dei campioni di pelle come dimostrato in precedenza in questo video, immergere i campioni in una provetta da due millilitri con tappo a scatto con un millilitro di reagente per l'estrazione acida di guanidinio tiocianato fenolo cloroformio. Usa una pinza chirurgica per tagliare il tessuto in pezzi di 0,2 centimetri quadrati.

Con un mulino a perline, frantumare i campioni a 20 oscillazioni al secondo per 20 minuti. Se sono ancora presenti pezzi di pelle intatti, ripetere la frantumazione fino a quando il campione non è completamente omogeneizzato. Centrifugare i campioni a 16.000 volte g per un minuto.

Conservare i surnatanti per l'estrazione dell'RNA e scartare il pellet. Questo passaggio viene eseguito per eliminare peli e detriti che potrebbero interferire con il processo di estrazione. Dopo aver estratto l'RNA con una colonna di purificazione, utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione e la purezza dell'RNA.

Il mantenimento dell'integrità strutturale della pelle consente la rilevazione delle cellule immunitarie e la loro localizzazione nel sito di infezione. Questo elevato ingrandimento rivela che l'ascesso è composto principalmente da PMC che contengono la diffusione dell'agente patogeno attraverso il suo confinamento nel sito di infezione. Anche le aree circostanti l'ascesso sono arricchite da PMC.

In questa figura, la colorazione PAS, che conferisce al fungo un colore viola-magenta, mostra chiaramente che il patogeno è confinato all'interno dell'ascesso formato dal reclutamento dei granulociti. C. albicans è chiaramente visibile a un ingrandimento più elevato e sembra essere circondato da cellule necrotiche e immunitarie. All'inizio del processo di infezione, il reclutamento delle cellule immunitarie porta alla formazione dell'ascesso.

Da 48 a 72 ore dopo l'infezione, sono state visualizzate la rottura delle strutture cutanee e la formazione di una cicatrice a causa della fase di guarigione successiva all'espulsione dell'agente patogeno. Come mostrato qui, i topi wild type mostrano un processo ulcerativo che aumenta nel tempo. In seguito a trattamenti specifici o carenze genetiche, la formazione dell'ulcera può essere ridotta e/o abrogata.

In alcuni casi, invece di un'ulcera, si formerà una cisti come si vede qui. Dopo questa procedura di infezione, è possibile eseguire altri metodi come l'estrazione di proteine per rispondere a ulteriori domande come l'attivazione di specifici percorsi intracellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come eseguire l'iniezione di C.Albicans nella pelle per studiare il coinvolgimento del sistema immunitario durante l'infezione microbica senza interrompere l'architettura dell'epitelio.

Non dimenticare che lavorare con i reagenti per le estrazioni di RNA può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di una cappa aspirante.