إعداد Oligomer بيتا-اميلويد A11-إيجابية وتقييم استخدام دوت النشاف التحليل

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأدوية العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وموثوقة وقابلة للتكرار لتكوين أوليغومر بيتا أميلويد. نظهر أن عرض هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تحضير أوليغومر بيتا.

أولا ، اضبط تركيز محلول مونومر A-beta إلى 0.25 ملليغرام لكل مليلتر عن طريق إضافة 900 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج إلى الأنبوب. ثم استمر في تبخير محلول المونومر بغاز نيتروجين عالي النقاء حتى يصل الحجم إلى حوالي 850 ميكرولتر بتركيز حوالي 0.29 ملليغرام لكل ملليلتر. يؤثر وجود HR5P على تكوين أوليغومر A-beta.

لذلك ، يعد التبخر قدر الإمكان خطوة حاسمة في هذا الإجراء. بعد ذلك ، استخدم الماء المقطر المزدوج لتخفيف محلول مخزون الكركمين لتحضير محلول عمل 0.2 واثنين من الضرس الصغير. حافظ على نسبة واحد إلى واحد واخلط محلول A-beta مع الكركمين لتحقيق التركيز النهائي للكركمين عند 0.1 وميكرومولار واحد.

ثم اترك المحلول على المحرض المغناطيسي. قم بتوصيل صندوق مقسم بلاستيكي بالمحرض المغناطيسي. ضع قضيبين مغناطيسيين للتحريك في زاويتي الصندوق ، ثم ضع الأنابيب مع العينات في وسط الصندوق.

استمر في هز الصندوق في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة بمعدل 60 دورة في الدقيقة ، ثم قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 18،000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، اجمع المادة الطافية. لتحليل نشاف النقاط ، خذ غشاء النيتروسليلوز وقم بتقطيعه إلى شرائح بعرض سنتيمتر واحد ، ثم ضع ميكرولترين من العينة بالتساوي على الشريطين الأول والثاني مع كل فاصل نقطي عند 0.5 سم.

عند رش العينة على الغشاء ، من الضروري أن تنتشر بالتساوي ويتم التحكم في القطرات المختلفة بحيث لا يتم ربط العينات المختلفة ببعضها البعض. بعد ذلك ، احتضن الشرائط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق حتى تجف القطرات. بعد خمس دقائق ، احتضن الشرائط بألبومين مصل البقر بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد انتهاء الحضانة ، اغسل الشرائط باستخدام محلول TBST المؤقت لمدة خمس دقائق. قم بشفط المخزن المؤقت بعد الانتهاء من الغسيل ، ثم احتضن الشريط الأول بالجسم المضاد المضاد لقلة A11 وقم بتجريد اثنين بمحلول الأجسام المضادة المضادة A-beta 6E10 لمدة ساعة. بعد ساعة واحدة ، اغسل الشرائط باستخدام TBST لمدة خمس دقائق كل ثلاث مرات ، ثم استنشق المخزن المؤقت واحتضان الشرائط بمحلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة 40 دقيقة.

بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل الشرائط مرة أخرى باستخدام TBST لمدة خمس دقائق كل ثلاث مرات. بعد ذلك ، أضف حوالي 300 ميكرولتر من سائل ECL المختلط إلى سطح الشرائط الرطبة ، ثم قم بتعريض الشرائط في نظام تصوير التلألؤ الكيميائي التلقائي. تظهر دراسات TEM عدم وجود أي مجاميع مرئية في محلول مونومر A-beta المذاب بتقنية HFIP ، ولكن بعد 48 ساعة من الحضانة ، يشكل نفس المونومر قلة القلة ، وهي عبارة عن مجاميع كروية بشكل أساسي يبلغ قطرها من 10 إلى 80 نانومتر.

عند إخضاع مونومر A-beta والعينات الغنية بالأوليغومر لتحليل اللطخة النقطية ، فإنه يظهر وجود أوليغومرات A-beta إيجابية A11 في عينات غنية بالأوليغومر A-beta. ومن المثير للاهتمام ، أن ببتيدات A-beta الإيجابية A-beta 6E10 موجودة في كل من مونومر A-beta والعينات الغنية بالأوليغومر. بعد ذلك ، يتم إجراء تحليل شبه كمي أيضا للتعبير عن مونومر A-beta الإيجابي للأجسام المضادة والعينات الغنية بالأوليغومر كنسبة مئوية من التحكم.

ببتيدات A-beta الإيجابية A11 أعلى بكثير في العينات الغنية بالأوليغومر A-beta مقارنة بالمونومرات. على العكس من ذلك ، يوجد ببتيد A-beta الإيجابي A-beta 6E10 في كل من العينات الغنية بالمونومر والأوليغومر. في الواقع ، يتم أيضا احتضان أوليغومرات A-beta مع مثبطات أوليغومر الكركمين وبيتا.

يؤدي الكركمين إلى انخفاض كبير في الكمية النسبية من أوليغومر A-beta الإيجابي A11 مع انخفاض تلطيخ A11 في عينات أوليغومر A-beta المحتضنة بشكل مشترك من الكركمين. ومع ذلك ، فإن التركيزات المتفاوتة من الكركمين لا تؤثر على عدد ببتيدات A-beta في المونومر الإيجابي 6E10 والعينات الغنية بالقلة عند مقارنتها بالعينات الإيجابية A11. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في عدة ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف الأدوية المرشحة للاضطرابات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أوليغومر A-beta وتقييم كميته.