凝胶神经元全细胞斑块夹的急性脊髓切片的制备
January 18th, 2019
在这里, 我们描述了由体外脊髓切片中的明胶 (sg) 神经元制成的全细胞膜片夹记录的基本步骤。该方法可对 sg 神经元的固有膜特性、突触传递和形态表征进行研究。
这种方法有助于澄清感觉传播、异常调节和慢性疼痛或疼痛发展背后的脊髓机制。首先使用毛细管拉拔器从硅酸盐玻璃微胶囊中拉出记录电极。然后，用熔融的加糖填充模具，准备一个1.2厘米1.5厘米由2.0厘米的加糖块。
如果规划横向部分，修剪块以具有中央通道。或具有抛物线部分块边缘的通道肉。在转心性灌注和脊髓提取之前，准备500毫升的蔗糖为基础的ACSF。
使用 95%O2 和 5%CO2 冷却冰冷溶液并均衡。冷却冰上所有的解剖工具。在背部皮肤上做一个纵向五厘米切口，从肌科达尔到罗斯特拉。
然后，切开脊柱和两侧肋骨之间的肋骨笼。用剪刀在脊柱的骨端做切口。然后切开周围的组织，并迅速分离脊柱的隆起部分。
将 lumbosacral 段转移到含有冰冷蔗糖的玻璃盘中。与腹侧向上，使用精细剪刀切开椎骨，并小心地暴露脊髓。用凸体扩大分离脊髓的两厘米长部分，将脊髓部分转移到另一个装满冷蔗糖ACSF的玻璃盘中。
在解剖显微镜下工作，去除梅宁和皮亚蜘蛛膜。尽快切开所有心根和后根。切中时注意避免脊髓受伤，尤其是后节角。
将脊髓放在先前修剪的胡须块上。要准备横向切片，请将脊髓的腹侧连接到带侧朝刀片的 agar 上。要准备寄生虫片，请将带超级胶水的腹侧垂直连接到阿加。
然后，将阿加块安装到具有超级胶水的振动器的平台上。并准备300至500微米横向或副卫星切片，高级速度为0.025毫米/秒，振动频率为80赫兹。脊髓应被切入多索-呼吸。
为了获得最佳效果，应在 15 到 20 分钟内准备切片。脊柱片的厚度不应超过600微米，以满足细胞的可见度。使用塑料修剪移液器将切片转移到 32 摄氏度的连续氧化 ACSF 的存储室中的尼龙网上。
要进行来自亚斯坦蒂娅胶质酶或SG神经元的全细胞贴片夹记录，请使用基于钾离子的细胞内溶液进行记录，同时仅应用基于钙的阳离子溶液进行抑制性后突触电流的记录。轻轻地将脊髓切片移动到记录室。然后用带尼龙线的 U 形铂线牢固地稳定住，以实现最佳的切片稳定性。
在室温下用气泡ACSF稳定地将切片进行，将灌注速率设置为每分钟2至4毫升，以实现足够的氧合。然后，使用低分辨率显微镜透镜，将SG神经元区域识别为半透明带。选择一个健康的神经元，其特征是三维形状，以明亮光滑的膜作为目标细胞，使用高分辨率目标，并调整到视频监视器屏幕的中心。
用适当的钾离子或基于钙离子的细胞内溶液填充微移液器。然后将微移液器插入电极支架，并确保细胞内溶液与支架内的银线接触。将微型移液器对焦，并使用微操纵器将它浸入 ACSF 中。
施加温和的正压，以强制清除任何污垢和碎屑。逐渐将微移液器移向目标神经元。一旦移液器接近神经元，神经元膜上形成非常小的酒窝，释放正压形成千兆酶。
将保持电位改变为负70毫伏，接近细胞的生理静膜电位。然后，对微移液器施加瞬态和温和的吸力，以破裂膜，并创建良好的全细胞配置。通过测试当前夹钳中每个神经元的点火模式，用一秒去极化电流脉冲 25 到 150 皮安，在静膜电位下以 25 皮安增量记录点火性能。
要记录体电位电位，在电压夹紧模式下将膜电位保持在负 50 毫伏，然后应用一系列超极化电压脉冲，持续时间从负 60 毫伏到负 120 毫伏，并降低 10 毫伏。在负70毫伏的保持电位下，在电压夹紧模式下，使用基于钾离子的细胞内溶液记录突触后兴奋电流。记录 IPSC 使用基于 caesium 离子的细胞内溶液记录 IPSC 的。
将膜电位保持负70毫伏约5分钟后，逐渐将保持电位更改为零毫伏。等待几分钟以稳定，然后开始记录 IPSC 事件。通过将一系列一秒去极化电流脉冲注入休息膜电位上的 SG 神经元而确定的点火模式可分为补品激发、延迟射击、间隙激发、初始爆发、磷爆炸、单尖峰和不情愿的激发。
此图显示了电压夹中低于额定电流的唤起协议。这些代表性跟踪显示了对分类为 IH、IA 和 IT 的超极化电流注入的反应。这是SEPSC在50微摩尔 APV 和 20 微摩尔 CNQX 不存在的情况下从 SG 神经元以负 70 毫伏记录的代表踪迹。此跟踪显示在扩展时间刻度上添加 APV 和 CNQX 之前记录的 SEPC。
遵循这个程序是方法，如配对补丁夹状或光遗传学可以执行回答其他问题，如描述特定神经元微电路在亚斯坦蒂娅胶质。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This study outlines the procedures for conducting whole-cell patch-clamp recordings from substantia gelatinosa (SG) neurons within in vitro spinal cord slices. By employing this method, researchers are able to investigate intrinsic membrane properties, synaptic transmission, and the morphological characteristics of SG neurons.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Electrophysiology
- Cell Biology
Background
- The substantia gelatinosa is critical for understanding sensory processing and pain regulation.
- Whole-cell patch-clamp can elucidate the electrophysiological properties of these neurons.
- This method enhances neuronal preservation and simulates in vivo conditions.
- Understanding SG neurons can provide insights into chronic pain mechanisms.
Purpose of Study
- To describe the methodology for patch-clamp recordings in spinal cord slices.
- To investigate the inherent properties of SG neurons.
- To explore synaptic transmission in relation to pain mechanisms.
Methods Used
- Whole-cell patch-clamp recordings performed on in vitro spinal cord slices.
- The biological model focuses on substantia gelatinosa neurons.
- No multiomics workflow is mentioned in the text.
- The critical steps include preparing a sucrose-based ACSF, isolating the spinal cord segment, and slicing the tissue within specific time constraints.
- Recording techniques include adjusting holding potentials and identifying neuronal properties under a microscope.
Main Results
- The study presents a protocol for identifying and recording from SG neurons, allowing detailed characterization of their electrophysiological properties.
- Electrophysiological changes and firing patterns can be analyzed to gain insights into neuronal excitability and synaptic dynamics.
- Key biological responses include characterizations of tonic-firing and other firing patterns based on experimental conditions.
- The method facilitates the exploration of pain modulation mechanisms based on synaptic activities.
Conclusions
- The described methodology enables the investigation of SG neuron functionality and is crucial for understanding pain pathways.
- The method's precision and preservation of neurons enhance its applicability in neuroscience research.
- Findings contribute to a better understanding of the mechanisms underlying chronic pain and sensory transmission.
