Dosage standard d’alimentation par membrane pour la détection de l’infection à Plasmodium falciparum chez les moustiques vecteurs anophèles

Le protocole nous permet de détecter l’effet du traitement sur la susceptibilité au paludisme des vecteurs africains du paludisme. Par exemple, des composés visant à bloquer la transmission de l’homme au moustique. Cette technique permet aux chercheurs d’évaluer un grand nombre de composés dans des conditions de laboratoire, avant même que les GATE de toxicité ne soient disponibles.

Les dissections de l’intestin moyen peuvent être difficiles au début, mais il suffit de pratiquer. Aussi, pouvoir identifier les oocystes n’est pas toujours facile. Tout d’abord, à l’aide d’un aspirateur buccal, placez 25 moustiques femelles Anopheles gambiae non nourries dans une tasse d’alimentation de 350 millilitres.

Étiquetez clairement les gobelets pour faire la distinction entre le groupe témoin et le groupe de traitement. Choisissez le nombre de tasses par traitement en fonction du nombre de répétitions techniques incluses. Connectez le système d’alimentation en verre à un bain-marie et maintenez la température à 37 degrés Celsius.

Ensuite, préparez l’intestin de vache ou la membrane synthétique en le rinçant à l’eau du robinet et en le coupant en morceaux qui sont ajustés pour chaque mangeoire. Couvrez la partie inférieure de chaque chargeur et fixez la membrane avec une bande élastique. Pour utiliser les gobelets d’alimentation comme gobelets d’infection, gardez d’abord la membrane au-dessus des filets des tasses.

Ensuite, placez les gobelets d’infection sous les mangeoires. Maintenant, ajoutez un millilitre de sang infecté par des gamétocytes aux mangeoires des gobelets témoins, et du sang infecté par des gamétocytes avec un composé de test aux mangeoires des gobelets de traitement. Ensuite, laissez les moustiques se nourrir pendant environ 40 minutes.

Après l’alimentation, retirez les mangeoires des tasses, rincez les mangeoires et traitez l’excès de sang avec de l’hypochlorite. Ensuite, renversez tous les moustiques sur la glace pendant une à deux minutes et sélectionnez les moustiques qui ont pris un repas de sang en recherchant les abdomens enflés et rouges. Remplacez l’eau sucrée qui est donnée un jour sur deux à chaque tasse d’infection par un tampon d’eau sucrée à 10% et incuber les tasses d’infection dans une chambre de biosécurité pendant huit à 10 jours.

Huit à 10 jours après l’alimentation, abattez les moustiques infectés en les plaçant sur de la glace. Ensuite, transférez-les dans des tubes marqués contenant 70% d’éthanol, en gardant le contrôle dans chaque groupe de traitement dans des tubes séparés. En gardant les groupes de contrôle et de test séparés, transférez les moustiques dans des boîtes de Petri étiquetées doublées de papier filtre.

Ajoutez une goutte de PBS sur une lame de verre correctement marquée et transférez un moustique du papier filtre à la goutte. Épinglez le thorax du moustique avec une aiguille à disséquer. Ensuite, retirez l’intestin moyen en tirant le septième segment abdominal avec une pince et transférez-le dans une gouttelette de mercurochrome à 0,1% sur une nouvelle lame de microscope.

Laissez l’intestin tacher pendant huit à 10 minutes. Ensuite, placez un couvercle sur l’intestin taché et visualisez-le sous éclairage en champ clair à un grossissement de 20 à 40 fois. Notez le nombre d’oocystes par intestin moyen pour le groupe témoin et chaque groupe de traitement.

Dans cette étude, le composé MMV1581558 s’est avéré limiter de manière significative le nombre d’oocystes de Plasmodium falciparum dans l’intestin moyen des moustiques femelles Anopheles gambiae par rapport au témoin. Dans le groupe témoin, la prévalence moyenne des oocystes dans l’intestin moyen était de 89% avec une intensité moyenne de 9,5 oocystes par intestin moyen. Mais dans le groupe traité par MMV1581558, la prévalence moyenne des oocystes était de 36% avec une intensité moyenne de seulement 1,5 oocyste par intestin moyen.

Ainsi, le traitement par MMV1581558 a entraîné une activité de blocage de transmission de 58% et une activité de réduction de transmission de 82% dans les trois réplicats biologiques. Il est essentiel de s’assurer que les moustiques se nourrissent d’une culture de gamétocytes saine. S’il s’agit de gamétocytes immatures ou de gamétocytes de stade cinq, la probabilité de contracter une infection chez le moustique est limitée, voire impossible.

Le test utilise une méthode d’identification morphologique visuelle, mais des tests de quantification moléculaire peuvent être utilisés. Cela est toutefois plus coûteux et pourrait limiter leur utilisation dans les laboratoires aux ressources limitées. Avoir la capacité de faire cette technique ouvre de nouvelles voies pour évaluer le changement de la prévalence et de l’intensité du paludisme entre presque tout ce qui se trouve chez les moustiques.

Par exemple, comparer la capacité vectorielle des espèces.