Cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) sono uno strumento promettente per studiare l'omeostasi vascolare e la riparazione.<sup> 1,2</sup> Questo documento introduce un nuovo metodo di siero animale libero per l'isolamento e l'espansione del ECFC da eparinizzato adulti sangue umano periferico con un pool di lisato piastrinico umano (pHPL) diminuendo il rischio di immunizzazione anti-bovino.
Abstract
Questo lavoro introduce una nuova strategia di recupero per le cellule progenitrici endoteliali formanti colonia (ECFCs) da eparinato ma per il resto non manipolata adulto periferici umani all'interno di una media di 12 giorni. Dopo l'espansione su larga scala> 1×10 8 ECFCs può essere ottenuto per ulteriori test. Vantaggiosamente utilizzando pHPL il contatto delle cellule umane con antigeni siero bovino può essere escluso. Mediante citometria di flusso ed immunoistochimica delle cellule isolate può essere caratterizzato come ECFC e la loro funzionalità in vitro per formare strutture di tipo vascolare possono essere testati in un test di Matrigel. Inoltre queste cellule possono essere iniettati per via sottocutanea in un modello murino di forma funzionale, vasi perfusi in vivo. Dopo un lungo periodo di espansione e la proliferazione crioconservazione, la funzione e la stabilità genomica sembrano essere conservati. 3,4
Questo animale-proteina isolamento libero e il metodo di espansione è facilmente applicabile a generare una grande quantità di ECFCs.
Protocol
A.) ECFC ISOLATON GIORNO 1: Prima di iniziare con l'esperimento preparare la cultura della crescita delle cellule endoteliali medio a medio-2 (EGM-2). Supplemento 500ml endoteliale basale medio-2 con eparina (1 ml di 1000 U / ml), 5 ml soluzione 100x di penicillina / streptomicina (tutti Sigma, St. Louis, MO, www.sigmaaldrich.com ), L-glutamina (concentrazione 2 mM finale ), e 50 ml pool lisato piastrinico umano (pHPL). Quindi aggiungere…
Discussion
Questo isolamento romanzo e il metodo di espansione è un processo semplice ed efficiente che è più efficiente e meno che richiede tempo, evitando qualsiasi separazione cellulare (gradiente di densità non necessario) e meno costoso rispetto alle tecniche convenzionali. Usando contatto pHPL agli antigeni della specie bovina e putativo xenoimmunization successivo è esclusa. Durante il periodo di cultura piccoli coaguli si possono formare, causata dal pHPL. Sulla base della nostra esperienza di questi coaguli di non ef…
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Dott. Katharina Schallmoser per la fornitura di pHPL e Margaretha Frühwirth e Daniela Thaler per un'eccellente assistenza tecnica.
Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524, doi:10.3791/1524 (2009).