Bewertung von immunologisch relevanten dynamischen tertiären strukturellen Merkmale der HIV-1 V3-Loop Crown R2 Sequence durch Ab initio Folding

Summary

Die Krone Region unterschiedliche V3-Loop-Sequenzen von der Oberfläche Hüllglycoprotein (gp120) des HIV-1 kann strukturell in vielen Fällen gekennzeichnet durch in silico Faltung von Positionen 10 bis 22 der Schleife mit einer state-of-the-art

Abstract

Die antigene Vielfalt der HIV-1 ist schon lange ein Hindernis für die Impfstoff-Design worden, und diese Variabilität ist besonders in der V3-Schleife des Virus 'Oberfläche Hüllglycoprotein ausgeprägt. Wir haben bereits vorgeschlagen, dass die Krone des V3-Loops, obwohl dynamische und variable Reihenfolge, in der gesamten Bevölkerung von HIV-1 Viren auf eine immunologisch relevante β-Haarnadel Tertiärstruktur ist eingeschränkt. Wichtig ist, gibt es Tausende von verschiedenen V3-Loop-Sequenzen Krone in zirkulierenden HIV-1 Viren, die Herstellung von 3D strukturelle Charakterisierung von Trends in der Vielfalt der Viren erschweren oder unmöglich durch Kristallographie oder NMR. Unsere bisherige erfolgreiche Studien mit Faltung der V3 Krone ^{1, 2} verwendet die ab initio-Algorithmus ³ zugänglich in der ICM-Pro Molecular Modelling-Software-Paket (Molsoft LLC, La Jolla, CA) und schlug vor, dass die Krone des V3-Loops, und zwar aus Positionen 10 bis 22, Leistungen ausreichend von der Flexibilität und Länge der flankierenden stammt zu einem großen Teil verhalten, als ob es ein ungezwungenes Peptid frei Faltung in Lösung wurden. Als solche schnellen Ab-initio-Faltung nur diesen Teil des V3-Loops von einzelnen Stamm der 60.000 + zirkulierenden HIV-1 Stämme können sehr informativ sein. Hier, gefaltet wir die V3-Loop des R2 anstrengen, um Einblick in die strukturelle Grundlage seiner einzigartigen Eigenschaften zu gewinnen. R2 trägt ein seltenes V3-Loop-Sequenz als verantwortlich für die exquisite Empfindlichkeit dieses Stammes zur Neutralisation von Patientenseren und monoklonalen Antikörpern ^{4, 5.} Die Belastung vermittelt CD4-unabhängige Infektion und scheint breit neutralisierenden Antikörper hervorzurufen. Wir zeigen, wie Auswertung der Ergebnisse der Faltung kann informativ für die Zuordnung von beobachteten Strukturen in der Faltung mit der immunologischen Aktivitäten für R2 beobachtet.

Protocol

1. Methodik

1. Der erste Schritt des Protokolls ist es, die V3 Krone Sequenz, die Sie wollen in silico fach zu wählen. Für die R2-Stamm, ist die Reihenfolge für dieses Fragment KSIPMGPGRAFYT.
2. Die 3D-atomare Struktur des Peptids entsprechend dieser Reihenfolge sollte in dem Computer den virtuellen Raum gebaut werden. Die ICM-Befehl dafür lautet:
   buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
   oder Datei: Neu: Peptide können unter dem Pull-Down-Menü ausgewählt werden
3. Verschiedene Parameter des Verfahrens werden dann gesetzt, darunter die Anzahl der Suchschritte (Länge der Suche), die Simulation Temperatur, Suchstrategie Parameter einschließlich der variablen Beschränkungen für Verzerrungen der Suche nach angemessenen Bereichen, energetisch, die Auswahl der verschiedenen Energiequellen Berechnungsmethoden, und Parameter angeben, wie die Suche, z. B. ob ein Film aufnehmen wird aufgezeichnet und wie viele Zwischenstufen Scoring Konformationen sollten aufgezeichnet werden. Alle diese Parameter wurden von früheren Publikationen (siehe www.molsoft.com) optimiert worden.
4. Die Faltung wird dann mit dem Befehl gestartet:
   montecarlo
   oder Datei: Neu: Peptide können unter dem Pulldown-Menü Molecular Mechanics gewählt werden: Minimieren: Global
   
   Im ersteren Fall, sollten die Parameter aus Schritt 3 nacheinander in der Kommandozeile gesetzt werden. Im letzteren Fall sind die Kontrollkästchen für die am häufigsten gewählten Parameter in einem Bereich vorgesehen, bevor der Befehl ausgeführt wird. Der Einfachheit halber wird die gleiche Faltung ICM-Skript für dieses Experiment und bisher veröffentlichten Experimenten verwendet hier gezeigt:
   
   Dieses Skript kann in einer Textdatei gespeichert und ausgeführt werden aus dem Betriebssystem des Computers Kommandozeile (in der Regel LINUX) schnell mit dem Befehl:
   icm _foldingscript
   

2. Secrets to Success

1. Der V3-Loop ist eine Konstante, 35 Aminosäuren lang in fast allen bekannten Stamm, so dass die Aminosäure-Positionen 1 bis 35 nummeriert sind, beginnend mit dem Ursprung Disulfid gebundene Cystin bei 1 und endet mit dem entsprechenden Disulfid gebundene Cystin bei 35. Da es Teil einer Schleife ist, sollten die Grenzen der Krone des V3 sorgfältig ausgewählt werden. Wenn eine zu große Fragment gewählt wird, ist es unwahrscheinlich ist, als frei flexible Segment verhalten, als ob es ein freies Peptid wurden, so die Faltung Simulation wird nicht korrekt beurteilen die Struktur. Wenn eine zu kleine Fragment gewählt wird, kann die informative Tertiärstruktur nicht in die Simulation zu bilden. Unsere früheren Studien zeigten, dass das Fragment von Position 10 bis Position 22 mit dem Antikörper gebunden kristallographischen Konformationen korreliert, so ist dies das Fragment einer V3-Schleife, die für die Faltung gewählt werden sollte.
2. Obwohl die Verwendung der grafischen Benutzeroberfläche und Pull-Down-Menüs ist einfach zu bedienen, bedarf der vorherigen erfolgreichen Arbeit auf Peptidfaltung in der Regel mit ICM und V3-Loops Krone Falten insbesondere die oben beschriebenen Skript verwendet werden, einfache Änderung der Reihenfolge in der buildpep Linie und den Betrieb der obige Skript von der Kommandozeile wird empfohlen.

3. Repräsentative Ergebnisse

Die Ergebnisse für die R2 Falten sind repräsentativ für die Ergebnisse für jeden V3-Schleife. Zur Auswertung der Ergebnisse sollte die Projekt-Datei (es wird mit dem Namen "newProject1.icb" aus dem obigen Skript sein) geöffnet werden und "Molecular Mechanics, Stapel, View" gewählt. Eine Tabelle des Stapels Konformationen erscheint. Der Stack Konformationen können grafisch visualisiert werden, indem Sie auf den Plot / Histogramm-Symbol. "Molecular Mechanics, Stapel, Play" wird ein Film des Stapels, um visuell zu schätzen wissen die konformative Präferenzen durch die Faltung aufgedeckt. Für die R2-Sequenz wird die Konformation beta-Haarnadel-artige wie für V3-Loops ² erwartet - vor allem in dem Fragment an den Positionen 12 bis 14, wo eine klare β-Strang-Bevorzugung im ganzen Stapel zu sehen ist, und nur sehr wenige alpha-Helices zu sehen sind. Darüber hinaus ist eine Energielücke von fast 3 Einheiten zwischen dem niedrigsten Energie-Konformation und die zweitniedrigste Energie Konformation gesehen. Aus energetischer Sicht bedeutet dies, dass die Struktur nur flackert aus der niedrigsten Energie Konformation weniger als ein Prozent der Zeit: die Faltung Ergebnisse schlagen daher vor, dass die R2 V3 Krone einer starren, anstatt flexible, Struktur ist. Möglicherweise gibt es weitere wichtige strukturelle Merkmale in das Ensemble von Konformationen werden, aber sie sind kaum systematisch zu schätzen wissen.

	JRFL	SF162_V3JRFL	SF162_V3R2
447-52D GMT 50	15	0,00061	0,00078

Tabelle 1: Relative Neutralisierung JRFL und R2 V3-Loops in maskierten und nicht maskierten Einstellungen. Die Daten wurden zuvor in Cardozo T., et al. ARHR (200 gemeldet8) und Pinter, A., et. al J. Virol (2004). SF162_V3JRFL enthält die JRFL: Kurz gesagt, wurde eine neutralisierende Aktivität mit einem Single-Cycle-Infektiosität Assay mit PSV mit dem env-defekten Luciferase-exprimierenden pNL4-3.Luc.RE-Plasmid pseudotypisiert mit dem JRFL Env oder SF162 V3 oben beschriebenen Varianten generiert ermittelt V3-Loop-Sequenz anstelle des SF162 V3-Loop-Sequenz. SF162_V3R2 enthält die R2 V3-Loop-Sequenz anstelle des SF162 V3-Loop-Sequenz. Der PSV wurden mit seriellen Verdünnungen der 447-52D mAb für 1,5 h bei 37 ° C und anschließend an CD4 + CCR5 hinzugefügt + U87 Zielzellen in 96-Well-Platten in Gegenwart von Polybren (10 mg = ml) beschichtet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit RPMI-Medium mit 10% FBS und 10 mg = mL Polybren durch eine zusätzliche 24-48 h Inkubation folgte wieder zugeführt. Luciferaseaktivität wurde 48-72 h nach Infektion mit einem Mikrotiterplatten-Luminometer (HARTA, Inc.) mit Assay-Reagenzien von Promega, Inc. geometrischen Mittelwerte der Titer für 50% Neutralisation (GMT50) von 447-52D bestimmt wurden durch Interpolation aus der Neutralisation Kurven bestimmt und sind Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen Assays.

Discussion

Ab-initio-Falten zeigt tertiären strukturellen Eigenschaften, deren Auswirkungen sich möglicherweise nicht offensichtlich aus dem Studium einzelner Aminosäuren nacheinander. Mehrere vorher obskure strukturellen Eigenschaften der R2 V3 loop Krone durch die Faltung Simulation enthüllt. Diese beobachteten strukturellen Präferenzen können mit den beobachteten funktionellen Eigenschaften der R2-Stamm, nämlich Empfindlichkeit gegenüber Neutralisation und hyperinfectivity ⁵ korrelieren.

Zunächst wird eine klare β-Strang-Tendenz in der N-terminalen Hälfte des R2 V3 Krone bei Position 12-14 beobachtet. Dies ist der Ort der R2-Stamm ist ungewöhnlich Isoleucin-Prolin-Methionin (IPM)-Sequenz. Von kristallographischen Strukturen der 447-52D, 2219, Be48, 2557, 2558 und 537-D anti-V3-Schleife gebundenen Antikörpern V3 loop Peptide, Positionen 12 bis 14 des V3-Loops sind durch diese Antikörper gebunden, und wenn gebunden, das Segment übernimmt ein lokaler β-Strang-Konformation. Die Faltung Simulation so nahe, dass die R2 V3 loop Krone eine Konformation bevorzugt an den Positionen 12 bis 14, die komplementär zu bekannten Anti-V3-Loop neutralisierende Antikörper ist. Diese Präferenz kann erklären die beobachteten Empfindlichkeit gegenüber Neutralisation von dieser Sorte.

Zweitens zeigt die Simulation eine Lücke von 3 Energieeinheiten zwischen dem niedrigsten Energie-Konformation und die zweitniedrigste Energie Konformation, was auf eine starre Struktur. HIV-1 gp120 ist ein äußerst dynamisches Molekül, die einen großen Konformationsänderung von seiner ungebundenen, immunologisch geschützt (unliganded) bilden, um seine menschliche Rezeptor gebunden und immunologisch ausgesetzt (mit Liganden) bilden. Die Flexibilität der V3-Schleife verlangt werden kann, kooperativen Übergang zu bewirken, und die starre R2 V3-Loop-Struktur beobachtet hier kann widerstehen Verlagerung aus der mit Liganden bilden, ähnlich wie ein starrer Block könnte etwas schwieriger sein, um tuck weg in einem kleinen Raum im Vergleich zu einen weicheren flexible blockieren. Dieser Widerstand gegen die Übernahme des unliganded Form aussetzen kann V3-Loop, der CD4-Bindungsstelle und CD4 induziert Neutralisation Epitope, die alle charakteristisch in der Form von mit Liganden gp120 ausgesetzt sind. So kann die beobachtete Starrheit auch konzeptionell zu den beobachteten Neutralisation Empfindlichkeit des R2 Belastungen verbunden sein.

Da die Co-Rezeptor interagiert Form der V3-Schleife ist wahrscheinlich auch eine β-Haarnadel wie die Formen von neutralisierenden Antikörpern ausgerichtet werden, legen die Ergebnisse nahe, dass die R2 V3 Krone in den Co-Rezeptor und neutralisierende Antikörper komplementäre Form, ist gesperrt, die wiederum kann die ganze gp120 in seine mit Liganden Form zu fördern, so dass die Belastung hoch infektiös. So beobachteten Konformationsänderungen und Steifigkeit sowohl auch konzeptionell mit R2 hyperinfectivity in Verbindung gebracht werden.

Diese Anordnung eines starren, sondern ausgesetzt Co-Rezeptor und Antikörper komplementäre Konformation des V3-Loops unterscheidet sich von einer flexiblen, aber begraben oder V3-Schleife, die typisch für HIV-Stämme ist maskiert. Folding des JRFL Stamm (der den Konsens Subtyp B HIV-1 V3-Loop-Sequenz aufweist) zeigt ebenfalls eine β-Strang-Präferenz, aber viele eng verteilt niedrigsten Energie Konformationen suggestive der V3 Krone Flexibilität (Daten nicht gezeigt). Die Vorhersage wäre, dass diese V3-Loop-Sequenz wäre sehr empfindlich auf die Neutralisation durch eine entsprechende Antikörper wie 447-52D, wenn sie ausgesetzt waren, statt begraben. Wie erwartet, sind die JRFL und R2-Sequenzen gleich empfindlich, wenn in einer exponierten Lage inmitten eines chimären SF162 pseudovirus, in dem die V3-Schleife durch die JRFL oder R2 V3-Loops (Tabelle 1) ersetzt wird vorgestellt, aber das gleiche JRFL V3-Schleife ist völlig unempfindlich zur Neutralisation, wenn in seiner nativen JRFL Kontext präsentiert.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass die ungewöhnliche IPM Reihenfolge der R2-Stamm eine starre, Antikörper-binding-site-kompatibel, Co-Rezeptor-Bindungs-Ort-kompatible Form in die wichtigsten Kronenbereich des V3-Loops verleiht. Die Steifigkeit wird angenommen, dass die konformative Flexibilität des gp120, wie es Übergänge zwischen mit Liganden und unliganded Formen behindern, Sperren weitgehend in seine mit Liganden bilden, wo die Antikörper-optimal, Co-Rezeptor-optimale Form in der V3 Krone ausgesetzt und ist verfügbar. Das Ergebnis ist die Empfindlichkeit der Neutralisation und hyperinfectivity der R2-Stamm. Auf diese Weise ist die ab-initio-Faltung Experiment in diesem Protokoll beschriebenen informativ für HIV-Impfstoff-Forschung: die Faltung für R2 hier beobachtet werden kann für HIV-1-Vakzine Immunogen-Design wichtig wie eine Ahnung, wie Sie gp120-basierte Immunogene in bevorzugten lock , Neutralisation sensitive Konformationen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICM-Pro	Molsoft LLC