Summary
توضح هذه المقالة الإجراءات التجريبية التي استخدمت في إعداد الأوتار ذيل فأر النشاط الحيوي للدراسات وmechanobiological. وأظهرت العديد من الميزات من الخطوات الرئيسية في إعداد وبداية مع الاستخراج ، مستعرضة قياس المجال ، والشطف والتحميل في غرفة مفاعل حيوي.
Abstract
الأوتار ذيل فأر (RTTs) هي نموذج مشترك البيولوجية المستخدمة في الدراسات التجريبية في المختبر في مجال علم وظائف الأعضاء ووتر tendinopathy. العمل مع تلك الأنسجة يشكل تحديا لأنها هشة للغاية ، وحتى الآن لم يكن هناك بروتوكول مفصلة بدقة عن عزلتهم.
مواجهة هذه التحديات ، قمنا بتطوير الأساليب والأدوات اللازمة لتسهيل التلاعب والسيطرة RTTs الأنسجة الجدوى ، والعقم والنزاهة. توضح هذه المقالة الإجراءات التجريبية التي استخدمت في إعداد دراسات عن RTTs النشاط الحيوي وmechanobiological. وينقسم عملنا إلى أربع خطوات رئيسية : الاستخراج ، مستعرضة قياس المجال ، والشطف والتحميل في غرفة مفاعل حيوي.
في كل خطوة ، وتعرض جميع الاجراءات والمواد والتلاعب في التفاصيل بحيث يمكن أن تتكرر بسهولة. وعلاوة على ذلك ، تعرض أدوات محددة وضعت : لوحة التلاعب المستخدمة لعزل RTTs ، وهو ميكرومتر البصري إلى موقف الأنسجة خلال قياس مساحة المقطع العرضي ، ونظام رسو إرفاق RTTs على مفاعل حيوي.
أخيرا ، نحن تصف النتائج التي تم الحصول عليها بعد عدة اختبارات للتحقق من وسائلنا. جدوى ، والعقم والنزاهة التقييمات تثبت أن إجراءات صارمة بما فيه الكفاية لدينا هي للتلاعب من الأنسجة الهشة مثل الأوتار ذيل الفئران.
Protocol
قبل أي تلاعب ، يجب التعرف على مجموعة من الأوتار لاستخدامها اعتمادا على التجربة تديرون والجهاز الخاص في التصرف. لأغراضنا ، تم اختيار الأوتار بطني لأنها أصغر حجما وبالتالي أسهل للتلاعب عند قياس مساحة المقطع العرضي والمناسب لهم في غرفة مفاعل حيوي.
يرجى ملاحظة أن جميع الصكوك تعقيمها أو تعقيم مع الايثانول 70 ٪. علاوة على ذلك ، وضعت زجاجة رذاذ يحتوي على الايثانول بنسبة 70 ٪ بجانب كل محطة العمل على تعقيم القفازات المجربون قبل كل عملية.
الجزء 1 : استخراج
بعد استئصال ، يتم التلاعب بعناية الذيل القصوى لتجنب إتلاف الأنسجة. أيضا ، للحفاظ على بقاء الخلية ، وحملت كل التلاعبات في محلول ملحي بارد.
1A) المواد :
- محلول ملحي بارد (D - PBS)
- سحق الجليد
- سطح حامية
- قطع متنها
- لوحات التلاعب الفردية
- 2 500 مل الأطباق
- 2 أطباق زجاجية 2L
- شريط لاصق
- 1 الملقط
- 1 الملقط
- 1 الملقط الوقوف
- 1 زوج من المقصات الجراحية
- 1 المبضع
- 1 زوج من مقص جراحي
الشكل 1. التلاعب في تحديد الميول الفردية ("ف" ل "دان")
1B) محطة العمل :
- انتشرت الحامي السطحية ووضع قطع المجلس في القمة.
- ملء كل طبقين أكبر الزجاج في منتصف الطريق مع الثلج المجروش ووضعها على الورق.
- العصا قطعة من الشريط على ركلة ركنية من لوحة التلاعب وتحديد بحرف لتشير إلى نهاية القريبة.
- شغل اثنين من أطباق زجاجية صغيرة في منتصف الطريق إلى أخاديد وجميع لوحات التلاعب مع محلول ملحي بارد. وضعها في أطباق زجاجية كبيرة تحتوي على الجليد.
- تنظيم جميع الأدوات معقمة على الحامي السطح.
- نقل الذيل في واحدة من صحن الزجاج تحتوي على محلول ملحي.
1C) التلاعب :
- مراقبة التشريح في نهاية القريبة من الذيل لتمييز الجانب البطني من الجانب الظهري. الجانب البطني لديها أكبر عدد من الأوتار والأوعية الدموية التي يمكن التحقق منها عن طريق الضغط بلطف الذيل لإنتاج قطرات صغيرة من الدم.
- باستخدام المقص الجراحي ، قطع الجلد على طول الجانب الظهري من الذيل إذا كنت تريد استخراج الأوتار بطني (أو على طول الجانب البطني إذا كنت في حاجة إلى الأوتار الظهرية).
- فتح شق في نهاية الداني وإزالة الجلد باستخدام الملقط أو أصابعك والتلاعب بعناية نهايات الذيل.
- شطف الدم والشعر في محلول ملحي ونقل العينات الى صحن من الزجاج يحتوي على حل ما تبقى طازجة. تغيير القفازات.
مقطع عرضي ينظر تحت المجهر يظهر ضوء وتر المجموعات الست. ويرد واحد من كل مجموعة وتر الى نهاية الذيل من كل فقرة ، حتى نقطع على القرص الفقرية لفضح الأوتار جديدة على خفض الانتاج.
الشكل 2. القسم متقاطع من ذيل فأر ينظر تحت المجهر الضوئي. - قطع نهاية البعيدة من خلال فقرات 2-3 الغضروف أقصر مع المقصات الجراحية. مكان الذيل على لوح التقطيع لقطع الأنسجة اللينة باستخدام مشرط ومن ثم استبدال ذلك على الفور في الحل.
- باستخدام الملقط ، وسحب من أصل واحد وتر من ذيل القاصي.
- مع الاستمرار في كلا طرفي طيف ، ضع الأوتار في لوحة التلاعب الفردية.
تكرار الماضي خطوتين حتى يمكن مثار ليس أكثر من الأوتار ، وقطع واحد فقرة أقصر كلما أنسجة جديدة يجب أن يتم كشفها.
الجزء 2 : مستعرضة قياس مساحتها 7
عندما يمر الأنسجة توصيف ميكانيكية أو التحفيز ، موصوفة خصائصه الميكانيكية تطبيع القوة داخل الوتر للإجهاد. هذا هو السبب في أن نقيم منطقة مستعرضة.
2A) المواد :
- البصري ميكرومتر
- Stereomicroscope
- كاميرا رقمية
- التعرف على حافة والخوارزميات إعادة الإعمار الشخصي 5،6
- محلول ملحي بارد (D - PBS)
- 1 الحجم الصغير 20 200μL ماصة
- 1 مفتاح الهيكس لإجراء تعديلات ميكرومتر البصرية
- 2 الملقط
/ files/ftp_upload/2176/2176fig3.jpg "بديل =" الشكل 3 "/>
الشكل 3. الميكرومتر البصرية
2B) محطة العمل :
- فتح برنامج (الكاميرا الرقمية والخوارزميات).
- ضع ميكرومتر البصرية حتى لا يكون هناك مساحة كافية لتحميل وتر في الجهاز.
- تنظيم الصكوك وصحن من الزجاج يحتوي على استخراج الأوتار في متناول اليد.
2C) التلاعب :
- ملء المقصورة قياس مع محلول ملحي بارد حتى غمرت كلا النظامين مرساة.
- نقل الوتر في المقصورة من خلال عقد ينتهي مع ملاقط.
- باستخدام الشفط عبر ماصة الصغيرة الحجم ، وسحب one أقصى في وقت واحد في أنبوب السيليكون. نضح حتى نهاية يتجاوز الياقات رمح.
- تشديد أطواق رمح لضغط الأنابيب وتثبيت جهاز تحت stereomicroscope.
- في التكبير 105X ، وتمتد الأوتار مع مراعاة النسيج حتى الطويات لم تعد محسوسة. تمتد بنسبة 0.40 إضافية.
الشكل 4. الإسقاط وتر في التكبير 105x قبل وبعد التمدد. - ضبط الموقف ، والتركيز على الحفاظ على صورة واضحة لأكثر من وتر تناوب 180 درجة.
- التقاط صورة في كل تناوب 10 درجة التوتر دون تعديل ، والتركيز أو الموقف. فقط استخدام رمح دوارة لتنفيذ التناوب. بسبب شكل مخروط لها ، قد يتم تكرار هذه الخطوات في نقاط مختلفة على طول الوتر.
- تنشيط الاعتراف حافة ملف إعادة الإعمار والخوارزميات لتحليل قاعدة البيانات لديك مسجلة.
- حرر في الوتر من خلال تخفيف والياقات رمح وتهب الهواء في أنابيب السيليكون باستخدام ماصة حجم الصغير.
- معاودة وتر على لوحة التلاعب والمناولة مرة أخرى من قبل الطرفين.
- التحقق من شكل ملف إعادة الإعمار التي تم الحصول عليها وقيمة المنطقة مستعرضة.
الجزء 3 : الشطف
لإزالة التلوث التي قد تكون وقعت خلال التلاعب السابقة ، يتم شطف الأنسجة تحت مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
3A) المواد :
- محلول ملحي بارد (D - PBS)
- متعددة تلم التلاعب صفيحة
- لوحات معالجة الفردية
- شريط لاصق
- 2 الملقط
- 1 الملقط الوقوف
3B) محطة العمل :
- بدوره على المروحة في الدقائق 15 لمجلس الوزراء في مجال السلامة الأحيائية مقدما وتنظيف الأسطح في الداخل مع الايثانول 70 ٪.
- إحضار جميع الأدوات المتعلقة بالسلامة الأحيائية داخل مجلس الوزراء.
- العصا قطعة من الشريط على ركلة ركنية من كل لوحة الفردية لتحديد نهاية القريبة.
- ملء كل الأخاديد بمحلول ملحي معقم.
3C) التلاعب :
- يعرض لوحة تحتوي على التلاعب استخراج الأوتار في مجلس الوزراء.
- باستخدام الملقط ، إزالة وتر من لوحة لها مع وجود فهم لطيف على كل نهاية.
- غمر ويحرك بلطف وتر في محلول ملحي من كل حجرة من التلاعب وحة متعددة الأخدود ، بدءا من الأقرب والانتقال إلى أبعد الأخدود.
- أخيرا ، ويغرق في وتر في لوحة التلاعب الفردية.
الجزء 4 : تحميل مفاعل حيوي في الغرفة
لتجنب حدوث مزيد من التلوث ، وتجرى أيضا التلاعب التالية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
4A) المواد :
- مفاعل حيوي غرفة 4
- معقمة المراسي
- 1 طبق بتري معقمة
- البرد متوسطة الخلية المثقف (DMEM)
- Cyanoacrylate
- 2 الملقط
- ملاقط الوقوف
- 0.5 10μl الصغيرة الحجم ماصة
- 1 حاكم
الشكل 5. تفاعلات الاحيائية الغرفة
4B) محطة العمل :
- منذ أن أدركت أيضا الخطوة السابقة لمجلس الوزراء في مجال السلامة الأحيائية ، والتخلص من الأدوات الضرورية يمنحك المزيد من مساحة العمل.
- إحضار جميع الأدوات الأخرى داخل مجلس الوزراء.
4C) التلاعب :
- مكان مرتكزا على لوحة التلاعب مع التخزين المؤقت في طيرانها فوق اقصى وتر الجرح والنسيج صعودا وحول التخزين المؤقت.
- لفة ومرساة على الاستمرار على أقصى فضفاض ، مع ضمان أن تبقى الأنسجة التي تعلق على مرساة. بعد توقف ¾ بدوره.
- تنفيذ نفسالخطوات مع الطرف الآخر.
- لفة على حد سواء المراسي على حد سواء حتى يكون هناك 6 سم بين مراكزها 1.
- تخفيف وتر أن تزج به في حل والسماح للأقسام الراسية لتجف لفترة وجيزة لتعزيز خصائصه الميكانيكية 2-3.
- صب cyanoacrylate في طبق بتري ولفت الى 2.5μL ماصة حجم الصغير.
- تطبيق قطرة cyanoacrylate للأنسجة الجرح المتابعة دون أن يخسر أي الغراء في محلول ملحي. كرر حتى طبقت 2 قطرات كل مرساة.
- مع وتر لا تزال مغمورة تماما ، وانتظر 5 دقائق للالغراء لتجف تماما.
- خلال هذا الوقت ، وملء حجرة حجرة بمحلول ملحي.
- ترطيب جميع الأنسجة بمحلول ملحي لمنع الضرر.
- فقط عن طريق التلاعب في المراسي ، ونقل الى غرفة وتر مفاعل حيوي وإغلاقه لمنع التسرب والتلوث أثناء النقل.
الجزء 5 : نتائج الممثل :
نتائج البروتوكول يبين أنه عندما يقوم بشكل صحيح ، عزلتنا نسيج دقيق وتحضير العملية تجعل من الممكن للحفاظ على عقم الأنسجة ، وسلامة ونزاهة.
الأولى ، وذلك باستخدام طريقة استخلاص بسيطة ومتكررة ، ونحن قادرون على استخراج الأوتار الذيل دون الإضرار شبكة الكولاجين ويمكن ملاحظة ذلك من خلال تحليل مجهري للأقسام H & E الملوث أدركت بعد الاستخراج.
الشكل 6. وتر شبكة الكولاجين بعد استخراج (المقطع الطولي 5μm ملطخة H & E).
نحن الأوتار ثم تربيتها لمدة تصل إلى عشرة أيام ، وأجريت اختبارات العقم. كل يوم ، ونحن المحتضنة مطلي حل المستخدمة في الثقافة وأغار لمدة 24 ساعة. منذ أن يلاحظ أي نمو البكتيريا ، وخلصنا إلى أن التلاعب دينا لا ينتج عنها تلوث.
مع ملف إعادة الإعمار والخوارزمية ميكرومتر البصرية ، ونحن قادرون على تقدير مساحة المقطع العرضي ضمن هامش الخطأ 2 ٪ 7.
الشكل 7. التعمير الشخصي لRTT.
أخيرا ، قمنا بتقييم الجدوى باستخدام LIVE / الاستمرارية الميت / السمسة كيت لخلايا الثدييات بعد خطوة الشطف والثقافة بعد فترة اثني عشر يوما. منذ أغلبية كبيرة من الخلايا الحية الخضراء الفلورسنت كانت واضحة ، لا يمكننا التأكد من أن الإجراءات عزلتنا ناجحة في الحفاظ على الأنسجة الحية. تم إجراء نفس الاختبار بعد ساعتين ربط الأوتار في غرفة مفاعل حيوي. علينا التحقق من أن الجفاف والغراء في مرساة لم تنتشر في الأنسجة بين كل المراسي.
الشكل 8. البقاء في الأنسجة المرساة (أخضر = الخلايا الحية ، أحمر = الخلايا الميتة)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من خلال تطبيق هذه الإجراءات التجريبية ، يمكننا إجراء مجموعة واسعة من الدراسات في المختبر على هذا النوع من الأنسجة. وعلى سبيل المثال ، أجريت دراسة على تنكس النسيج بها تطبيق التحفيز تحت لRTTs لمدة عشرة أيام. كل يوم ، وقمنا بتقييم الخصائص الميكانيكية في الأنسجة غير مدمرة الاسترخاء اختبارات الإجهاد. في النهاية ، كنا قادرين على مراقبة RTT اختلاف الضغط وبالتالي تحليل تطور الخصائص الميكانيكية.
الرقم 9. RTT يؤكدون التباين الاسترخاء حوض تقييم الاختبار (اليوم 1 إلى 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد أيد هذا المقال من قبل # 299280 NSERC غرانت ، كما IRSST على منحة لالوالد زاي وFRSQ كما طالب بمنح البحوث الجامعية لسانسسير م. نشكر Yoan يميو - Laneville لأداء التلاعب سجلت على شريط فيديو.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-PBS | Reagent | Wisent Inc. | 311-410-CL | Saline solution |
| Glucose | Reagent | Wisent Inc. | 609-037-EL | Saline solution 1g/L |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Saline solution 1% |
| DMEM | Reagent | Invitrogen | 12800-017 | Culture solution |
| Sodium Bicarbonate | Reagent | Wisent Inc. | 600-105-CG | Culture solution 3.7g/L |
| FBS | Reagent | Wisent Inc. | 090150 | Culture solution 10% |
| Antibiotics-antimycotics | Reagent | Invitrogen | 15240-062 | Culture solution 1% |
| Optic Micrometer | Tool | Custom Made | ||
| Manipulation plate | Tool | Custom Made | ||
| Bioreactor chamber | Tool | Custom Made |
References
- Bennett, M. B., Ker, R., Dimery, N., Alexander, R. Mechanical properties of various mammalian tendons. J. Zool. Lond. A209, 537-548 (1986).
- Dupuis, D. Déshydratation de matrices collagéniques reconstruites in vitro: effets sur les propriétés mécaniques et histologiques [dissertation]. , Québec, Université Laval. Québec. 114-114 (1981).
- Haut, R. C. Age-dependent influence of strain rate on the tensile failure of rat tail tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 105, 296-299 (1983).
- Huppé, N., Lessard, J. -L., Langelier, E. A Bioreactor Design for the Mechanobiological Study of Soft Tissue Damage and Repair in Conditions that Provide the Best Approximation of Actual Use. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
- Langelier, E., Dupuis, D., Guillot, M., Goulet, F. &, Rancourt, D. Cross-sectional profiles and volume reconstructions of soft tissues using laser beam measurements. J Biomech Eng. 126, 796-802 (2004).
- Lee, T. Q., Woo, S. L. -Y. A new method for determining cross-sectional shape and area of soft tissues. J Biomech Eng. 110, 110-114 (1988).
- Parent, G., Cyr, M., Cousineau-Pelletier, P., Desbiens-Blais, F. &, Langelier, E. Current Techniques for the Evaluation of Cross-Sectional Area in Rat Tail Tendons Generate Significant Errors. 31st Canadian Medical and Biological Engineering Conference, 2008 Jun 11-12, Montreal, Canada, , Canadian Medical and Biological Engineering Society. (1985).
