Summary
Thermo Scientific Matrix çok kanallı pipet ile el gibi bir robot kullanarak qPCR için 96-iyi dizileri Biz ön microRNA kurulum ve analiz gösterecektir.
Abstract
Kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR), gen ekspresyon düzeyleri profil doğru ve değerli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Birçok avantajlarından biri, her bir deney için küçük miktarlarda girişi kullanırken gen ekspresyon profil diğer yöntemlere göre daha düşük bir algılama sınırı. Otomatik qPCR kurulum büyük tekrarlanabilirlik için izin vererek bu alanda geliştirdi. Her bir deney için aynı anda pek çok farklı genler profil sağlayan, kullanışlı ve hızlı kurulum, yüksek verimlilik deneyler için sağlar. Bu yöntem aynı zamanda iç plaka kontrolleri ile birlikte diğer tekniklerin ortak deneysel değişkenler azaltır. Biz son zamanlarda bir dizi 186 primer çiftleri kullanarak ön microRNA profil qPCR assay (ön miRNA'ların) geliştirdi. MicroRNA yeteneği ile birçok mRNA transkripsiyon sonrası seviyede hedefler düzenlemek için küçük, non-coding RNA'ların bir roman sınıf olarak ortaya çıkmıştır. Bu küçük RNA'lar sonra habercisi miRNA (pre-miRNA) bölünmüş bir birincil miRNA (pri-miRNA) transkript, ilk olarak, RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu. Ön-miRNA'lar Dicer olgun miRNA'lar verim saç tokası döngü parçalayarak sitoplazma ihraç edilmektedir. MiRNA düzeylerde artışlar yararlı olabilir, hem de bu formları habercisi ve olgun miRNA düzeyleri ve profil hem görülebilir. Olgun miRNA'lar için piyasada bulunan birçok deneyleri vardır; bununla birlikte, yüksek maliyetli bu profil tekniği araştırmacılar caydırıcı olabilir. Burada, ön miRNA'lar profil maliyet-etkin, güvenilir, SYBR tabanlı qPCR yöntemi tartışacağız. -MiRNA öncesi düzeylerinde değişiklikler genellikle olgun miRNA değişiklikleri yansıtmak ve olgun miRNA ifade yararlı bir göstergesi olabilir. Yedeksiz bilgi katkıda bulunmak ve microRNA işleme içgörü sağlayabilir Ancak, pre-miRNA'lar ve olgun miRNA'lar hem de eş zamanlı olarak profil optimal olabilir. Ayrıca, burada açıklanan tekniği, özel yollar veya patojenler için diğer kütüphane setleri profil kapsayacak şekilde genişletilebilir.
Protocol
QPCR ön miRNA profilleme dizileri Tecan Özgürlük Evo robot (A) ya da elle Matrix elektronik çok kanallı pipet (B) tam otomatik olarak ayarlanabilir.
1) master mix, astar plakaları ve örnekler hazırlayın.
- 12:05 96-iyi biçimi (2 plakalarının toplam) 186 primer çiftleri içeren Astar plakaları, -80 ° C'de muhafaza edilmelidir Oda sıcaklığında, girdap ve kullanılmadan önce santrifüj kısaca çözülme plakalar.
- Ana karışımı hazırlamak için, SYBR Green 2x PCR Mix oda sıcaklığında çözünme. Her reaksiyon 2ul astar 8ul ana karışımı kullanır. Başına ana reaksiyon karışımı kompozisyon 4ul SYBR karışımı, 3ul PCR sınıf su ve 10-20 ng örnek DNA veya cDNA.
- Her 96-sıra astar plaka kurulum için dört ana karışımı tüpler ihtiyaç duyulacaktır. Örnekleri plaka başına 4 örnekleri (singlicate), 2 plaka başına örnekleri (yinelenen) veya dört nüsha olarak tek bir örnek çalıştırılabilir.
- 4-2ml Eppendorf tüpleri her SYBR, su ve örnek bir araya getirerek ana karışımı hazırlayın. Her tüp atık pipetleme fazla izin veren yaklaşık 100 reaksiyonlar için yeterli ana karışımı içermelidir. Karıştırmak için Vortex.
Özgürlük Tecan Evo robot kullanarak ön miRNA tahlil A. Kur.
- Robot ve yükleme Evoware programının başlatılması ardından, doğruluğu pipetleme engel olacak hava kabarcıkları sistemi temizlemek için 30mls her üç kez yıkayın.
- Robot platformu Kur şunlardır:
- 384-plaka Etiketli
- 96-iyi astar plaka (1)
- Ana karışımları
- % 2 oranında çamaşır suyu içeren bir çukur
- Doldurulmuş bir sistem sıvı konteyner
- Boş atık kabını
- "Çalıştır" a iki kez seçerek otomatik robot çalışması başlayın.
- Programın sonunda, LightCycler 480 sızdırmazlık folyo ile 384-plaka ve conta kaldırın ve kısa bir süre santrifüj. Place otel konumu 1 384-plaka imzalandı.
- 2.2 adım ve yeni ana karışımları ve yeni bir 384-plaka ile astar plaka 2 için tekrar gidin.
- Otelin konumu 2 mühürlü plaka koyun.
- Otel LightCycler Yükleme ve iki kez "Çalıştır" ı seçin Open in new Evoware programı.
- Özgürlük Evo LightCycler içine otomatik olarak her plaka yük ve aşağıdaki SYBR-yeşil I / İKY bisiklet programı çalıştırın:
Ön (1 döngüsü):
4.8 rampa oranı az 5 dakika boyunca 50 ° ° / sn
4.8 yükselme oranı az 5 dakika boyunca 95 ° ° / sn
Amp (45 siklus):
Yükselme oranı 4.8 ° 15 saniye 95 ° / sn
62 2.5 rampa hızı 30 sn ° ° / sn
(Bu adım sırasında Tek veri toplama)
Erime eğrisi:
4.8 rampa hızında 5 sn ° 95 ° / sn
2.5 rampa oranı az 1 dakika süreyle 60 ° ° / sn
95 ° rampa 0,11 oran ° / sn sürekli
5 ° C başına satın almalar
Cool:
50, 30 saniye 25 rampa oranında ° ° / sn
- Özgürlük Evo LightCycler içine otomatik olarak her plaka yük ve aşağıdaki SYBR-yeşil I / İKY bisiklet programı çalıştırın:
B. Kur Matrix elektronik çok kanallı pipet kullanarak pre-miRNA tahlil:
- Yeri içeriğini bir rezervuar içine master karışımı tüp 1.
- 2-8ul tasfiye adım adım takip dağıtmak ana karışımı 16ul aspire elektronik pipet ayarlayın.
- Master miks 1 için de A1 ile başlayan 384 plaka (384-iyi ucu aralığı) diğer her kuyuya 8ul dağıtmak. (Yani kuyulardan A1, C1, E1, vb) ikinci 8ul sonra bir atık kabı ve imha ipuçları üzerinde sütun 3 (yani kuyulardan A3, C3, E3, vb.) Tasfiye hareket eder, dağıtır.
- Iyi A23 ulaşana kadar kalan 5 devir için bu model izleyin.
- Ana karışımı 3 (iyi, B1, D1, F1, vb başlangıç); master miks 4 (B2 başlangıcı, D2, F2, vb (iyi A2, C2, E2, vb) ile başlayan, ana mix 2 için tekrarlayın. .)
- Astar plaka aliquotting için, elektronik pipet 2ul aspirat ve tasfiye adım aşağıdaki 2ul dağıtmak için ayarlayın. 96-iyi astar plaka (AH) sütun 1 astar 2ul bir atık kabı ve imha ipuçları plaka üzerinde 384-kuyu, kuyu A1, C1, E1, vb Temizle içine koyun. D2 ve B2, F2, vb; B1, D1, F1; kuyuları A2, C2, E2 için tekrarlayın
- Tam 384 plaka aliquotted kadar her astar sütun için her 2 sütun üzerinde hareketli, satır 96-iyi primerler 2-12 için bu işlemi tekrarlayın.
- LightCycler sızdırmazlık folyo ve kısa süreli santrifüj Seal plakalar.
- SYBR Green I / İKY algılama biçimini kullanarak aşağıdaki ayarlara göre LightCycler 480 ve plakaları döngüsü içine yerleştirin plakaları:
Ön (1 döngüsü):
4.8 rampa oranı az 5 dakika boyunca 50 ° ° / sn
4.8 yükselme oranı az 5 dakika boyunca 95 ° ° / sn
Amp (45 siklus):
15 saniye boyunca 95 ° yükselme oranı4.8 ° / sn
62 2.5 rampa hızı 30 sn ° ° / sn
(Bu adım sırasında Tek veri toplama)
Erime eğrisi:
4.8 rampa hızında 5 sn ° 95 ° / sn
2.5 rampa oranı az 1 dakika süreyle 60 ° ° / sn
95 ° rampa 0,11 oran ° / sn sürekli
5 ° C başına satın almalar
Cool:
50, 30 saniye 25 rampa oranında ° ° / sn - Aliquotting, taze hazırlanmış ana karışımları kullanarak yeni bir 384-plaka içine astar plaka 2 kullanarak tekrarlayın.
Başarının Sırları:
PCR dizileri tasarımı önemli bir özelliği, her 186 primer çiftleri aynı tavlama sıcaklığı olması, aynı optimal PCR çalışması program ayarları plaka çalıştırılabilir.
Her yeni bir dizi çalışan örnekleri öncesinde üç kontrollerini kullanarak kontrol edilmelidir. Bu kontroller şunlardır:
1 su veya 0,1 x TE astar kontaminasyonu ekarte etmek için çalışan tüm primerlerin çalıştırın.
1 hiçbir taşınmasını sağlamak için, su / TE ve pozitif kontrol alternatif çalışır.
3 çalışan arasında yeniden sağlamak için, aynı pozitif kontrol kullanarak çalışır.
Ana karışımları taze hazırlanmış olmalıdır ve plakalar en iyi sonuçlar için 24 saat içinde çalıştırılması gerekir
Primer plaka folyo kuyuları arasında kontaminasyon riskini azaltmak için yavaş yavaş çıkarılmalıdır.
Sabit ipuçları ile bir robot kullanırken,% 2 oranında çamaşır suyu yıkama, su floş pipetleme her adım arasında ipuçları, yıkamak için gereklidir. Bu veriler aksi kontamine ve sonuçsuz sonuçlara yol açabilir taşınmasını önler ve ortadan kaldırır.
LightCycler ile bir tabak çalıştırıldıktan sonra, PCR kurulum odasında tekrar açılacak olmamalıdır. Bu PCR kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur.
Temsilcisi Sonuçlar:
qPCR sonuçları genellikle LightCycler analiz yazılımı belirlenen CT değerleri ile temsil edilmektedir. Başarılı bir vadede, genellikle pozitif örnekler için örnekler için, genellikle 20-35 arasında trafolarından bir dizi oluşur. Iyi bir vadede su örneklerinin, her zaman bir CT> 40 ve 37 üzerinde herhangi bir numune veya bir BT ile özel kuyular negatif veya tespit olarak kabul edilir. Genel bir kural olarak, bir BT <10 verimli örnekleri de güvenilir değildir ve daha fazla analiz dışında tutulmuştur. Örnek giriş değişimi için kontrol etmede yardımcı olur tayininde qPCR veri ve iç kontrollerin dahil analiz etmek için çeşitli yollar vardır. Pre-mir dizi, farklı örnekleri CT değerleri normalleştirmek için bir referans gen olarak sık sık kullanılan bir U6 kontrol astar, içerir. Bu normalize değeri delta CT değeri (DCT) olarak adlandırılır. Sonuçlar genellikle ham CT, DCT değeri olarak görülebilir ya da daha fazla standardize edilmiş değerleri analiz edilebilir.
Şekil 1, bir timecourse deney dört farklı örnekleri ön microRNA dizi analizi ısı haritası biçiminde sunulmaktadır. Her ön microRNA göreceli ifade gösterilen ve üç ana, farklı kümeler ortaya çıktı. Beklendiği gibi analiz öncesi MIRS çoğunluğu (Şekil 1A) küçük, önemsiz değişiklikler yapıldı. Ancak, ön microRNA küçük bir kısmını önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 1B) veya timecourse deney boyunca önemli ölçüde artmıştır (Şekil 1C). Her bir ön microRNA ifade düzeyleri bazal seviye olarak 0h timepoint (Örnek 1) normalize edildi. Bazı durumlarda, bazı kümelenmiş pre-microRNA da (let-7a, Şekil 1B eski) İlgi haritası analizi birlikte küme dikkat. Deney bağlı olarak, kümeler, viral enfeksiyon bağlı olduğunu ortaya çıkabilir, ortak bir molekül ya da sinyal yolağı tarafından düzenlenir-microRNA öncesi ya da önceden MIRS hücre türüne özgü bir ifade.
Biz de geliştirdik microRNA öncesi tahlil, Kaposi sarkomu, insan ön-MIRS ek İlişkili Herpes (KSHV) ve Ebstein Barr Virus (EBV) tarafından kodlanan bilinen viral öncesi microRNA ve genler bir dizi içerir. Bunlar hücre hattı ve kullanılan örnekleri viral durumuna bağlı olarak, pozitif veya negatif kontrol olarak kullanılabilir. Şekil 2'de, dört nüsha olarak işletilen bir KSHV negatif örnek ortalama akım trafosu gösterilmiştir. KSHV LANA önemlisi, çok hassas qPCR dizi bu örnek tespit değildi. Ancak, U6 - iç kontrol ve izin-7a - yüksek ifade insan öncesi microRNA saptanabilir düzeyde ifade edildi. Son olarak, beklendiği gibi, PCR-dereceli su negatif kontrol qPCR ürün verim vermedi.
Başarılı bir qPCR çalışması bir diğer göstergesi de örnekleri potansiyel kirlenme içine iyi bir fikir verebilir erime eğrisi analizi. Erime sıcaklığı kurmak için PCR işlemi tamamlandıktan sonra, plaka yavaş ısıtılır. DNA ipliklerini ayrı olarak, SYBR yeşil yayımlanan ve floresan sinyal azalır. Sıcaklık bu drop grafikler halinde oluşur ve örnek erime sıcaklığı olarak bilinir. DNA dizisi olarak, örnekler, birbirinden DNA mevcut olduğundan bir ergime sıcaklığına sahip olmamalıdır su negatif kontrol farklı sıcaklıklarda erir. Her bir primer çifti PCR ürünleri, benzer sıcaklıklarda erir. Örneğin, Şekil 3 çift aynı örnek kullanarak iki farklı astarlar için yeni bir erime eğrisi analizi gösterir. Bu iki primer çifti için erime sıcaklığı farklı ama örnek her çoğaltmak için aynı sıcaklıkta eriyen açıktır. Veya potansiyel olarak kontamine kötü bir örnek belirtileri giriş iki farklı kaynaklardan varlığını düşündüren çeşitli erime doruklarına içerebilir.
Şekil 1. Ön-microRNA imzalar roman qPCR tabanlı bir dizi kullanarak profil yoluyla ortaya çıkar. Ortalama deltaCTU6 hesaplanır ve standartlaştırılmış değerlere heatmaps olarak gösterilen 3 ayrı kümeler verimli ArrayMinerTM yazılımı yüklenir. (A) Ön microRNA ifade küçük değişiklikler ile gösterilmiştir. Seviyelerini önemli ölçüde azalmıştır Öncesi microRNA (B) veya (C) artış da gösterilmiştir. Kırmızı ifade seviyeleri temsil ederken Mavi ifade alt seviyelerine karşılık gelir.
Şekil 2 qPCR tabanlı bir ön microRNA dizideki iç kontrollerin dahil edilmesi . 3 farklı genler ve hiç bir şablon kontrolü için ham CT değerleri gösterilmiştir. U6 PCR H2O negatif kontrol olarak sunarken dahili bir pozitif kontrol olarak kullanılır. Let-7a-1-1 KSHV LANA kullanılan hücre hattı veya doku viral durumuna göre ya bir pozitif veya negatif kontrol olarak kullanılabilir normalde pek çok farklı hücre tipleri ifade microRNA.
Şekil 3-microRNA öncesi astar ve örnek kontaminasyon eksikliği zirve analiz Erime. Erime eğrileri LightCycler yazılım Tm çağrı analizi kullanılarak elde edildi. Yinelenen çalıştırmak aynı örnek için iki farklı primerler (Primer A ve B) gösterilmektedir. Her astar için erime sıcaklığı farklıdır. Ancak, örnek, örnek kontaminasyon eksikliği gösteren, sadece bir tepe vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
QPCR çok hassas bir çalışma örnekleri arasında gen ekspresyon düzeylerini karşılaştırmak için kullanılabilir testinin yanı sıra virüs durumda pozitifliği belirlemek için. QPCR dizileri kullanmanın yararı zaman kısa bir süre içinde her bir örnek için birçok primerler (bizim durumumuzda, astar 186 çift) çalıştırma yeteneği. Tecan Özgürlük Evo kadar azaltılmış olabilir bir deney ayarlamak için gerekli süreyi, ve robot doğruluk ve tutarlılık gibi bir pipetleme robot kullanarak pipetleme hataları azaltmak ve ortadan kaldırabilir. Burada Tecan Özgürlük Evo microRNA dizi, yanı sıra bir pipetleme robot erişimi olmayan laboratuarlar için uygulanabilir bir Matrix Elektronik Çok Kanallı Pipet kullanarak alternatif bir yöntem kurmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. tüm genlerin, maliyet ve reaksiyon sayısını azaltarak referans genlerin aynı plaka üzerinde çalışan tek bir set normalize çünkü qPCR dizileri de yararlıdır.
Belirtildiği gibi, böyle bir dizi tasarımı gerektiğinde bazı temel özellikleri vardır. PCR plaka tüm örnekleri aynı koşullarda çalıştırılması olacağından, aynı sıcaklık ve ayarları, ya da primer çiftleri fonksiyonu başarısız olacağını tasarım primerler için kritik öneme sahiptir. Primerler tasarlarken, dizileri homoloji ilgi ve başka genlerin gen olduğunu sağlamak için her zaman BLAST arama tarafından kontrol edilmelidir.
Dizi çalışırken, çevre steril ve yanlış pozitif yol açabilir PCR bulaşanların kritik. Mümkünse, PCR, PCR ürünleri hiç kullanılmamış steril bir çalışma kaput ya da ayrı bir temiz oda kurmak olmalıdır. Banklar vadede tamamlandıktan sonra Eliminase, su ve etanol ile yıkanmış ve en az bir saat süreyle UV ışınlarına maruz olmalıdır.
Bu tekniğin yararı, bu aynı stratejiyi, sadece farklı bir primer çifti kümesi içeren bir dizi ile miRNA dizi değiştirerek profilli genlerin herhangi bir kümesi için geçerli olmasıdır. Gösterilenlerden benzer bir yöntem çalıştırmak bütün bunlar - laboratuvar şu anda ön miRNA'lar, KSHV, EBV, p53 ve NFkB dizileri içerir. Laboratuarımızda için ekran için istediğiniz herhangi bir primer çifti için, hızlı ve güvenilir, yüksek verimli gen profilleme yapmak için bu testin esneklik sağlar.
Burada bir süre üzerinden aktivasyon üzerine profil miRNA ifade düzeyleri insan hücre hatları cDNA kullanarak dizi nitelendirdi. Karakterize hücre hatları yanı sıra, dizi klinik örnekleri analiz etmek için de kullanılır. RNA izolasyonu, cDNA sentezi, gen ekspresyonu karakterize etmek için bu diziyi kullanarak cDNA çalıştırılabilir. Bu genler enfekte hastalardan alınan örneklerde upregüle olan karakterize viral pozitifliği, veya gen ekspresyon profilleri belirlenmesinde yararlı olabilir. Özetle, otomatik qPCR tabanlı diziler zamanında moda doku ve hücre hatları genlerin geniş bir yelpazede çok hassas tespiti için izin tekrarlanabilir ve güvenilir testlerin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe DE018304, R01DE018281 tarafından desteklenmiştir. KT T32 GM07092-34 ve Grad Girişimi, Akdeniz ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü (HHMI) Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi bir hibe ile desteklenmektedir. PC T32 CA009156 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix Electronic Multichannel Pipette | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above) |
| Matrix Integrity Filter Tips, Sterile | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (or comparable tip for multichannel used) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Group | 05015243001 | 384-well version |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 Sealing Foil | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase Decontaminant | Decon Laboratories | 04-355-31 |
References
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention. J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).
- O'hara, A. J. Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma. PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).
