Summary
우리는 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 UV 방사선 다음 발생하는 복제 중간체의 구조를 식별하는 데 사용될 수있는 절차를 제시한다.
Abstract
DNA 손상의 존재에 정확 복제는 모든 세포 유형에서 관찰 널리 바로 인간 암의 개발과 관련된 것으로 세포 rearrangements 및 돌연변이 유발의 대부분을 담당하고 있습니다. 이러한 UV 방사선에 의해 유도되는 등 DNA의 손상, 심한 정확하게 게놈 템플릿을 복제 복제의 능력을 impairs. 유전자 제품의 숫자는 복제 템플릿에 DNA의 병변 생기면 필요한 것을 발견되었습니다. 그러나, 남은 과제는 복제하는 동안 어떻게 이러한 단백질 프로세스 병변을 확인할 수있다
Protocol
1. 성장과 자외선 조사.
- 0.4 % 포도당, 0.2 % casamino의 지방산 및 10 μg / ML의 thymine (DGCthy 매체) 및 100 μg / ML 암피실린와 보충 데이비스 중간 1 자란 플라스미드 pBR322를 포함하는 새로운 숙박 문화의 200μl가 pelleted입니다. 세포 펠렛은 다음 암피실린을 부족한 200μl DGCthy 매체에 resuspended 및 DGCthy 매체 20 ML을 예방하는 데 사용됩니다.
- 문화는 0.5의 OD 600 (~ 5 X 10 8 셀 / ML)를 37 떨고 인큐베이터에서 암피실린 선택 ° C 않고 재배하고 있습니다. 암피실린없는 성장은 어떤 돌연변이에서 발생할 수 비정상적인 또는 비생산적인 복제 중간체에 대한 선택을 방지합니다. 손상을 유발하는 자외선을 사용하는 경우는 자외선의 효과적인 복용량을 줄이고, 이러한 파장과 보호막 세포에서 강하게 흡수하기 때문에 또한, 미디어에서 암피실린의 제거가 필요합니다.
- 노란 불빛 아래에서 일하는 문화가 교반을위한 회전 플랫폼에서 15cm 직경 페트리 접시에 배치됩니다. 우리의 문화는 UVC 광도계를 사용하여 측정됩니다 ~ 1 J/m2/sec의 노출 율을 생산하는 15 와트 살균 램프에서 거리에서 배치됩니다. 문화 50 J/m2와 조사 후 다시에 즉시 배치하는 실험 기간 동안 37 ° C 배양기를 흔들어. 이 약을 평균 1 cyclobutane pyrimidine 이합체 ssDNA의 모든 4.5 킬로바이트에서 생산하고 있습니다. 노란색 조명 photolyase로 cyclobutane의 pyrimidine의 dimers의 photoreactivation - 반전을 방지할 수 있습니다.
2. DNA 격리.
- 복제 중간체가 검사 예정이다 때때로, 문화의 0.75 ML의 나누어지는는 0.75 ML 얼음 차가운 NET30 버퍼 (100 MM NaCl, 10 MM 트리스, 산도 8.0, 30 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))로 배치하고이 끝날 때까지 얼음에 위치 시간 코스입니다. 우리는 일반적으로 0 조사 샘플, 15, 30, 45, 60, 90 분, 90 분 시간 코스를 실행합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 차가운 온도를 효과적으로 복제 및 뉴클레오 티드 절단 수리를 중지 제공하고 있습니다.
- 각 예제 1.5 MG / ML 라이 소 자임하고 TE 0.2 MG / ML RNaseA (10 MM 트리스, 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 150 μl에 resuspended, 20 분 ° C 37 lysed 다음 pelleted입니다. 이 시점에서, 20 % sarkosyl의 proteinase K (10mg/ml)와 10μl의 10μl가 추가되며 부화는 1 시간을 위해 계속 허용됩니다. Proteinase K와 sarkosyl는 페놀 추출이 발생하기 전에 멤브레인 또는 단백질과 관련된 수의 DNA 조각을 출시하는 데 도움이됩니다. 적극적으로 복제 DNA가 흔히 단백질이나 막 단지에 바인딩되어 있기 때문에, 이것은 회복 아르 복제 조각의 수율을 높일 수 있습니다.
- 샘플은 다음 각 샘플에 페놀 2 볼륨을 추가하고 튜브가 부드럽게 5 분 거꾸로 의해 압축이 풀립니다. 다음 클로로포름 / isoamyl 알콜 (24 / 1) 2 볼륨이 추가되고 튜브가 부드럽게 5 분 다시 반전됩니다.
- 샘플 5 분, 각 샘플의 맨 수성 단계에 대한 microcentrifuge에서 14,000 rpm으로 centrifuged 아르 것은 제거하고, 새로운 튜브에 배치됩니다. 다음 클로로포름 / isoamyl 알콜 (24 / 1) 4 권이 추가되는 튜브는 부드럽게 5 분 거꾸로하고 있으며, 5 분 14,000 rpm으로 다시 centrifuged.
- 각 예제에서 상단, 수성 단계는 다음 비이커에 0.1X TE 250 ML에 수레 47mm 왓먼 0.025 μm의 기공 디스크에 각 시료의 100μl을 찾는하여 1 시간 동안 dialyzed입니다. 단일 스트랜드 지역 또는 지점 지점과 복제 구조 전단에 더 취약하기 때문에, 우리는 일반적으로 입을 넓게하고 전단 세력을 최소화하기 위해 면도날과 함께 피펫 팁을 잘라. DNA는 제한 효소로 소화되기 전에는 일반적으로, pipetting이 최소로 보관해야합니다.
- 각 샘플은 다음 복제의 기원에서 단 하류 플라스미드를 linearizes PvuII (뉴잉글랜드 Biolabs)으로 소화됩니다.
- 전에 아가로 오스 겔, 100μl 클로로포름 및 Bromophenol 블루와 크실렌 Cyanol를 포함 배의 로딩 염료 20μl에 로딩하기 위해 각 샘플에 추가 혼합하고 있습니다. 그런 다음, 로딩 염료를 포함하는 수성 단계의 40μl가 젤로로드됩니다. 구조적 편견, 구조 유물, 그리고 DNA의 전단을 최소화하기 위해,이 절연 절차는 세포 용해 다음과 같은 단일 스트랜드 지역, 침전물, 또는 DNA 샘플을 집중을위한 풍부하게 어떤 단계를 포함하지 않습니다.
3. 2D 젤 및 남부 분석.
- 2 차원 아가로 오스 겔 - 분석 3 수정됩니다. 1 차원은 제한된 DNA 샘플은 1V/cm에서 1X TBE의 0.4 % 아가로 오스 겔을 통해 실행됩니다. 10X TBE 주식 솔루션 중 하나 리터가 포함되어 있습니다 :
- 108g 트리스베이스
- 55g 붕소의 소산
- 40 ML 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0)
- 람다 힌드 III 크기 마커가 처음 차선에 로드된 다음 샘플은 다른 모든 차선에로드됩니다. 우리는 일반적으로 최초의 D를 실행imension는 12-15 시간을 ~. 차선을 건너뛰는 것은 쉽게 두 번째 차원의 캐스팅으로 차선을 슬라이스 수 있습니다. 낮은 전압과 낮은 %의 아가로 오스 겔은 주로 크기에 따라 DNA 조각을 분리하는 역할을합니다.
- 두 번째 차원 들어, 겔 차선은 큰 백정의 칼을 사용하여 첫 번째 차원 젤 밖으로 슬라이스하고 있습니다. 람다 힌드 III 마커를 포함하는 첫 번째 차선은 ethidium의 브로마이드 물들일 수 있습니다. 가이드, 농작물로 람다 힌드 III 마커를 사용하여 선형 플라스미드이 실행 것으로 예상됩니다 어디 아래 젤의 영역을 폐기. 이러한 조건에서 우리는 선형의 pBR322 약간 크실렌 cyanol가 얼룩 위에 실행 찾습니다.
- 두 번째 차원을 캐스팅하기 위해 각 레인은 빈 젤 캐스터의 상단에 수평으로 배치됩니다. 1X TBE의 1.0 % 아가로 오스의 솔루션은 55 ° C. 준비 및 냉각 이때 젤 솔루션은 완전히 겔 조각 커버해야하고, 두 번째 차원을 캐스팅에 부어있다. 젤 설정되면, 그것은 버퍼가 recirculate 수있는 전기 장치에 6.5V/cm에서 실행됩니다. 우리는 일반적으로 두 번째 차원 ~ 5.5-7 시간을 실행합니다. 높은 전압과 높은 %의 아가로 오스 겔 효과적으로 DNA 그들의 형태에 따라 조각뿐만 아니라 크기를 분리합니다. 비선형 모양 두 번째 차원을 통해 더 느리게 실행됩니다.
- 다음 전기는 젤은 다음 H 2 O에 씻어서이며, H 2 O와 씻어서 15 분 대한 0.25M 염산 400ml에 두 번 씻어, 다음 30 분 동안 두 번 400 ML 0.4M NaOH로 세탁. 산은보다 효율적으로 전송 작은 조각으로 부분적으로 닉에 DNA 분자를 제공 씻는다. 이 단계는 인해 큰 크기와 DNA 복제 중간체의 특이한 형태가 필요합니다.
- 젤의 DNA는 다음 Hybond N로 전송됩니다 + 나일론 막 4. 우리는 0.4M NaOH와 아래 알칼리성 전송 시스템을 사용합니다. 간단히, 0.4M NaOH에 배어 압지 두 개의 시트는 종이 타올의 대형 스택에 배치됩니다. 나일론 막 또한 0.4M NaOH에 배어 및 압지 위에 위치합니다. 젤 그런 다음 조심스럽게 NaOH 용액에 침수 압지의 다른 조각에 의해 다음이 위에 계층입니다. 마지막으로, 침수 압지의 긴 부분은 상단에 계층이며이 끝나는이 심지 역할을 0.4M NaOH 용액 1 L를 포함하는 요리에 게재됩니다. 우리는 일반적으로 6-12 시간의 DNA 전달하자.
- 나일론 막 제거, 배 SSC 버퍼에 20-30 초 씻어하고, 10.5ml Prehybridization 솔루션을 포함하는 하이브 리다이 제이션 롤러 병에 배치. 그런 다음 막은 ° C 회전 이상 6hrs에 대한 42 incubated입니다. Prehybridization 솔루션 :
- 5.0 ML 포름 아미드
- 0.5 ML 20% SDS
- 2.5 ML 20X SSC의 *
- 2.0 ML 50X Denhardt의 *
- 0.5 ML 살몽 정자 DNA (10mg/ml)
SSC와 Denhardt의에 대한 * 조리법은 5에서 찾을 수 있습니다
- prehybridization 기간 동안, 플라스미드 pBR322 1 μg는 [32 P] - dCTP 분류 로체 사용 알파가 제공하는 프로토콜에 따라 닉 번역하여 32P로 표시됩니다. radiolabeled 프로브 (100μl)는 98에서 잠복기에 의해 변성됩니다 ° 다음 스크류 캡 microcentrifuge 관에서 10 분 C, 그리고 얼음에 즉시 배치.
- 변성 프로브가 포함된 5.9 ML의 하이브 리다이 제이션 솔루션에 추가됩니다 :
- 3.0 ML 포름 아미드
- 1.5 ML SSC
- 1.0 ML H 2 O
- 0.15 ML 50X Denhardt의
- 0.10 ML 20% SDS
- 0.15 ML 10mg/ml 살몽 정자 DNA
- prehybridization 솔루션은 롤러 병 밖으로 부어 있으며 하이브 리다이 제이션 솔루션은 롤러 병이 다음 12hrs 이상 42 ° C 배양기와 회전에 반환됩니다 인치 부어 있습니다.
- 하이브 리다이 제이션 솔루션은 롤러 병 부어있다. 그런 다음, 얼룩이 회전 0.5X SSC, 42에서 0.1 % SDS ° C를 포함하는 세차 솔루션 ~ 150 ML와 롤러 병에 20 분 4 번 씻어입니다.
- 액체가 가시 사라진 때까지 마지막 세척 후, 멤브레인는 종이 타월에 배치됩니다. 막 그런 다음 폴리비닐 염화물 - 플라스틱 포장에 싸여 phosphorimager 화면에 노출됩니다. 우리는 스톰 840과 관련 ImageQuant 소프트웨어를 사용하여 방사능을 시각화하고 계량.
4. 대표 결과 :
그림 1. 플라스미드 복제 중간체는 UV - 유도된 DNA 손상의 존재와 부재에 보여집니다. PvuII의 마이 그 레이션 패턴이 2D - 아가로 오스 겔 - 분석에 의해 관찰된 플라스미드 pBR322를 소화 diagrammed입니다. 비 - 복제 선형 plasmids은 선형 4.4 - KB 조각으로 실행됩니다. 복제 plasmids 그들의 큰 크기로 인해 아닌 복제 조각보다 느리게 어떠한 마이 그 레이션되지 Y 모양의 구조를 형성nlinear 모양. 이 마이 그 레이션 패턴은 잘쪽으로 선형 영역에서 밖으로 뻗어 아크를 형성한다. 다음 UV - 조사를 두 번 Y 또는 X - 모양의 분자가 Y 모양의 분자의 아크보다 느리게 마이 그 레이션 원추 지역에서 관찰됩니다. 2D 젤 남부 분석 예제 32P - 라벨 pBR322와 탐지 즉시 UV 조사 및 UV 조사 (발행인의 허가를 재현) 후 15 분 후에 세포에 대해 표시됩니다.
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Discussion
UV - 유도된 손상의 존재와 부재의 야생 타입 세포에서 얻은 전형적인 결과는 그림 1에 표시됩니다. 세포가 급속하게 기하 급수적으로 성장 단계에있을 때 손상이없는 경우, 전체 플라스미드 DNA의 ~ 1 %가 Y 아크에서 찾을 수 있습니다. 차단 복제 포크가 손상 사이트에서 축적으로 조사에 따라, Y 모양 분자의 일시적 증가가 관찰됩니다. X - 모양의 복제 중간체는 또한 transiently 병변이 수리하는 경우와 상호 때까지 축적과 유지.
남부 분석 장소에서 복제 중간체는 정화, 플라스틱 빨대로 젤 밖으로 천공 수 있고, 전자 현미경으로 직접 관찰했다. 우리는 DNA 손상을 발생하고 이러한 돌연변이의 축적 이상 복제 중간체를 식별하는 복제 포크를 처리하는 데 필요한 유전자 제품을 식별하는 데 성공적으로이 방법을 사용했습니다. 또한,이 방법은 쉽게 DNA 손상의 다른 형태를 조사하기 위해 수정할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리가 실험실에서 작업이 NIGMS - NIH의 국립 과학 재단 (National Science Foundation)와 지역 부여 R15GM86839에서 경력을 수상 MCB0551798에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer |
| 0.025 μm pore disks | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Floating dialysis disks |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease |
| Nick-translation kit | Roche Group | 976776 | To make 32P-labeled probe |
| Blotting Paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | For Southern transfer |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
References
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