Summary
Этот протокол описывает высокой пропускной метод ферментативного гидролиза, которая использует микропланшетного для измерения и классификации фосфора в почве, как P моноэфиры, Р диэфиры и неорганических П. До 96 образцов могут быть измерены в свое время в стандартных лабораторных условиях.
Abstract
Многие виды органического фосфора (Р) молекулы существуют в пробах окружающей среды 1. Традиционные измерения P не обнаруживают этих органических соединений P, так как они не реагируют с колориметрическим реагентов 2,3. Ферментативный гидролиз (ГБ) является новым методом точно характеризующие органических форм фосфора в пробах окружающей среды 4,5. Этот метод только сфабрикованным в точности, фосфор-31 спектроскопия ядерного магнитного резонанса (31 Р-ЯМР)-метод, который стоит дорого и требует специальных технических training6. Мы адаптировали метод ферментативного гидролиза способны измерять три класса фосфора (моноэфира Р, Р диэфира и неорганических P) к системе микропланшетов читателя 7. Этот метод обеспечивает исследователей с быстрой и точной, доступной и удобной средства измерения P видов почв, осадков, удобрений и, в случае концентрированной, водных образцов. Это только высокую пропускную способность метода измерения формы и ферментом лабильность органических P, которые могут быть выполнены в стандартных лабораторных условиях. Полученные данные дает представление для ученых, изучающих системы содержания питательных веществ и эвтрофикации потенциал.
Protocol
1. Фосфор Добыча
- Подготовка 1L решения 0,25 М раствора гидроксида натрия (NaOH, 40,00 г / моль) + 0,05 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 292,24 г / моль).
- Добавить 30 мл NaOH + раствором ЭДТА до 2 г влажной или сухой почвы / образца в 50 мл коническую трубку.
- Инкубируйте при перемешивании в течение 16 часов при комнатной температуре.
- Центрифуга 3000 мкг в течение 3 минут.
2. Пример извлечения рН регулировки
- Передача 0,1 мл аликвоту в 1,5 мл микро-центрифуги трубы.
- Добавить 0,017 мл 2,5 М уксусной кислоты, 0,144 мл 0,4 М ацетатного буфера (70,5% ацетата натрия [CH 3 COONa, 82,03 г / моль] и 29,5% уксусной кислоты, рН 5,0), и 0,739 мл деионизированной воды.
- Конечный объем скорректированного экстракт будет 1 мл и окончательное рН будет 5,0.
3. Фермент маточного раствора Подготовка
- Подготовка 1 л 0,1 М ацетата натрия (CH 3 COONa, 82,03 г / моль) растворе, рН 5,0.
- Подготовка 2 х 10 мл растворов кислот фосфатазы складе в буфере ацетата натрия, подготовленный в шаге 3,1, что окончательные концентрации каждого 0,5 ед / мл.
Кислая фосфатаза типа I с Triticum aestivum (зародыши пшеницы, ГП, как правило, 0,5 мг U-1 твердых, EC 3.1.3.2)
Кислая фосфатаза типа IV-S от Solanum tuberosum (картофель, РР, как правило, 4,6 мг U-1 твердых, EC 3.1.3.2)
* Единицы активности определяются поставщиком, где 1 единица определяется как освобождение от 1 мкмоль ортофосфат для раствора в час при 37 ° C. - Разведите лиофилизированный нуклеазы P1 (ЕС 3.1.30.1) из Penicillium citrinum (грибы; NP1, как правило, 500 U мг -1 твердые) в одном мл деионизированной воды-это теперь можно хранить при температуре 4 ° C для дальнейшего использования.
- Внесите NP1 в один из 10 мл трубы подготовлен в п. 3.2, что конечная концентрация составляет 2,5 ед / мл NP1; осторожно перемешать путем обращения в несколько раз.
- Центрифуга двух 10 решений мл фермента 3000 мкг в течение 30 минут.
4. P Кривая калибровки и управления
- Подготовка 1 л на 1 мМ фосфат калия (К2НРО4, 174,18 г / моль) исходного раствора.
- Добавить 1 мл 1 мМ маточного раствора калия фосфата 1,5 мл трубки центрифуги и выполнять семь 0,5 мл серийные разведения.
- Откажитесь от первого трубку так, у вас есть 7 разведений от 20 нмоль-0,625 нмоль П.
- Передача 80 мкл из каждой пробирки в двух экземплярах на строки B - Н от стандартного 96-луночного планшета.
- Добавить 80 мкл буферного раствора ацетата натрия (раздел 3.1) к ряду колонн 11 и 12-это 0 нмоль P точки калибровки.
- В каждом столбце 11 и 12 теперь содержит 8 эталонных образцов от 0 до 20 нмоль нмоль неорганического фосфата.
- Колонка 10 будет содержать следующие элементы управления:
- Добавить 40μL ПП + GP раствора фермента + 40 мкл буфера ацетата натрия (раздел 3.1) для первых трех скважин в колонке 10.
- Добавить 40 мкл ПП + GP + NP1 раствора фермента + 40 мкл буфера ацетата натрия в течение следующих трех скважин.
- Добавить 40 мкл раствора ацетата натрия, содержащего 10 нмоль глюкозо-6 фосфата (C 6 H 11 Na 2 O 9 P • хН 2 O, 304,1 г / моль) + 40 мкл ПП + GP фермента решения для одной хорошо, и в финал также в колонке 10 добавить раствор ацетата натрия вместо раствора фермента.
5. Образец + фермент инкубации
- Каждый образец проходит испытания займут первые 9 скважин в 1 ряд стандартных 96-луночного планшета.
- Распределить 40 мкл рН с поправкой на экстрактах образцов из раздела 2 к скважинам в 1-9 до 8 строк.
- После всех образцах были распространены * использовать многоканальную пипетку для распространения ПП + GP раствора фермента в столбцы 1-3, ПП + GP + NP1 в столбцы 4-6 и буферного раствора ацетата натрия (подготовлен в разделе 3.1) в столбцы 7-9.
* На этом этапе должны быть выполнены быстро, чтобы заверить всех образцах получить эквивалентное время инкубации. - Обложка 96-луночный планшет с крышкой и инкубировать образцы + фермент решений, контроля и калибровочной кривой ровно 1 час при температуре 37 ° C.
6. Колориметрический Измерение выхода и история неорганической P
- Подготовка 50 мл каждого из следующих решений в деионизованной воде:
Решение *: 0,1 М аскорбиновой кислоты (C6H8O6, 176,12 г / моль) + 0,5 М трихлоруксусной кислоты (Cl3CCOOH, 163,39 г / моль)
Раствор В: 0,01 M молибдата аммония ((NH4) 2MoO4, 196,01 г / моль)
Решение C: 0,1 М цитрат натрия (HOC (COONa) (CH2COONa) 2 2H2O, 294,10 г / моль) + 0,2 М натрия арсенат (NaAsO2, 129,91 г / моль) + 5% ледяной уксусной кислоты
(CH3CO2H, 60,05 г / моль) * Решение должно быть готово в день. - Добавьте 25 мкл раствора SDS, 100 мкл раствора, 20 мкл Б решение и 50 мкл раствора и C для всех скважин в 96-а плели. Делайте это быстро многоканальную пипетку.
- Обложка пластинки и инкубировать 30 минут при комнатной температуре.
- Измерьте оптическую плотность при 850 нм в любом перестраиваемых микро-ридер.
7. Классификация соединений P
- Импорт исходных данных в электронных таблицах (например, Microsoft Excel).
- Участок неорганического фосфора калибровочной кривой: от 0 до 40 нмоль P на ось х и среднее дубликатов измерения абсорбции на вертикальной оси.
- Выполните линейной регрессии и найти уравнение линии наилучшего соответствия.
- Столбцы 1-3: Непосредственно применять калибровочной кривой-это фон неорганических П.
- Столбцы 4-6: Средние значения образца трех экземплярах и вычесть из контрольной группы (раствор фермента + P фоне неорганической) от валового абсорбции-это Р основе гидролизуемых моноэфиры P.
- Столбцы 7-9: То же, за исключением 7,5 вычесть значения абсорбции из столбцов 4-6 - это P из гидролизуемых диэфиры P.
- Преобразование абсорбции данные нмоль P выпущен с применением калибровочного уравнения.
- нмоль P выпустили могут быть связаны обратно в мг Р / кг оригинальных почвы. Кроме того, оценка пропорций каждого класса P также может быть полезным подходом для анализа данных.
8. Представитель Результаты:
Быстрый визуальный осмотр 96-луночного планшета после колориметрических химии предложит подсказки или нет процедура была выполнена правильно. Первое, что проверка уровня жидкости в каждую лунку при сканировании бокового профиля пластины. Там должно быть ровно 275 мкл реагентов во всех скважинах. Затем осмотрите цвет скважин трех экземплярах образца и дублировать калибровки скважин. Эти технические репликации должна быть такой же оттенок синего. Затем нанесите калибровочной кривой для двух скважин содержащих глюкозо-6 фосфата и убедиться, что они освободили всех 10 нмоль неорганических П. После полного извлечения P была измерена с помощью ICP-OES или альтернативный метод, убедитесь, что общая P значений, рассчитанных с помощью этого Протокол не может превышать сумму P, который был извлечен.
Примечание: Тщательное управление данными в электронной таблице поможет защититься от количественных ошибок. Вы будете иметь дело с большим количеством номеров сразу, поэтому создание шаблона будет время хорошо провели.
Рисунок 1. 96-луночного планшета Отображение результатов для 8 образцов (строки АГ) и калибровочной кривой (столбцы 11 и 12). Органы управления в колонке 10. Цвет повышение интенсивности между столбцами 1-3 и 4-6 происходит из-за гидролизованный моноэфира P соединений между столбцами 4-6 и 7-9 происходит из-за гидролизованных соединений P эфира.
Рисунок 2. Распределение классов П в 0,25 М NaOH-0,05 М ЭДТА экстракт образца почвы Вермонт использованием высокой пропускной ферментативного гидролиза. Ошибка полоски показывают стандартное отклонение, п = 3.
Discussion
По самой своей природе, экспресс-метод с использованием малых объемах требует большой осторожности. Поэтому наиболее важные шаги тех, которые связаны пипетирования решений на тарелку. Точная и, самое главное, в соответствии технику пипетки имеют важное значение для успеха этого анализа.
NaOH-ЭДТА добычи позволит большую часть P во многих образцах, характеризуется на три класса: ортофосфат, моноэфира P и диэфира П. Почвы, удобрения, осадков или любые другие экологические образца, который содержит NaOH-ЭДТА-извлекаемые P может быть охарактеризовано . P формы в пробах окружающей среды, не обязательно стабильное и эта техника будет обеспечивать образцы характеризуются, прежде чем образцы оказываются под угрозой, без необходимости использовать армию исследователей.
Этот анализ особенно удобна при большом количестве образцов, подлежащих обработке. Реагент потребности и пространства требования были уменьшены до приемлемого уровня (например, 1,5 мл микроцентрифужных трубы, а не 50 мл колб стекла). Это приспособление также ограничивает отходов производства.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим и Геологической службы США Вермонт водных ресурсов и озеро Центра исследований для предоставления финансирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
- Turner, B. L., Frossard, E., Baldwin, D. S. Organic phosphorus in the environment. , Cabi Publishing. Wallingford. (2005).
- Murphy, J., Riley, J. P. A modified single solution method for determination of phosphate in natural waters. Anal. Chim. Acta. 27, 31-36 (1962).
- Dick, W. A., Tabatabai, M. A. Determination of orthophosphate in aqueous solutions containing labile organic and inorganic phosphorus compounds. J. Environ. Qual. 6, 82-85 (1977).
- He, Z., Toor, G. S., Honeycutt, C. W., Sims, J. T. An enzymatic hydrolysis approach for characterizing labile phosphorus forms in dairy manure under mild assay conditions. Bioresour. Technol. 97, 1660-1668 (2006).
- He, Z., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Commun. Soil Sci. Plant Anal. 36, 1373-1383 (2005).
- Cade-Menun, B. J. Characterizing phosphorus in environmental and agricultural samples by 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy. Talanta. 66, 359-371 (2005).
- Johnson, N. R., Hill, J. E. Phosphorus species composition of poultry manure-amended soil using high-throughput enzymatic hydrolysis. Soil Sci. Soc. Am. J. 74, 1786-1791 (2010).
