Summary
हम एक chromatin immunoprecipitation (चिप) विधि प्रदर्शित करने के लिए माउस भ्रूण ऊतक में ऊतक विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति की शुरुआत के दौरान या बाद में ऊतक विशिष्ट जीन में कारक बातचीत की पहचान. इस प्रोटोकॉल व्यापक रूप से ऊतक विशिष्ट जीन सक्रियण के अध्ययन के लिए लागू हो सकता है के रूप में यह सामान्य भ्रूण विकास के दौरान होता है चाहिए.
Protocol
1. भ्रूण के अलगाव
नोट: संचालन से जुड़े सभी चूहों उपयुक्त जानवरों की देखभाल और उपयोग की नीतियों और प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाना चाहिए
- संभोग के बाद सुबह महिला माउस में एक संभोग प्लग की उपस्थिति के लिए जाँच करें और संवर्धन पुरुषों से उन्हें एक अलग पिंजरे में रखकर mated महिलाओं को अलग. दिन है कि संभोग प्लग मनाया जाता है की दोपहर 0.5 भ्रूण विकास के दिन (E0.5) माना जाता है.
- E8.5 में, (या इच्छित मंच, अगर अलग है), एक अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग कर माउस को बलिदान.
- 70% इथेनॉल के साथ euthanized पशु के पेट गीले और उदर गुहा खुला. आरोपण विकासशील भ्रूण की उपस्थिति का संकेत साइटों प्रत्येक गर्भाशय सींग (चित्रा 1 ए) की लंबाई के साथ व्यवस्था "एक तार पर मोती" के रूप में देखा जाता है. कैंची का उपयोग करना, दोनों गर्भाशय सींग निकालने के लिए, प्रत्येक आरोपण साइट व्यक्तिगत कटौती करने के लिए अलग (चित्रा 1 बी) और एक 100 मिमी पेट्री पकवान युक्त कमरे के तापमान (आर टी) में उन्हें जगह विच्छेदन मध्यम (DMEM, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 20 मिमी HEPES पीएच 7.4 60 μg / एमएल पेनिसिलिन, 2 मिमी स्ट्रेप्टोमाइसिन).
- संदंश का प्रयोग, गर्भाशय ऊतक (चित्रा 1C) से प्रत्येक भ्रूण और झिल्ली को हटा दें और उन्हें ताजा विच्छेदन माध्यम जगह.
- एक विदारक संदंश का उपयोग कर खुर्दबीन के तहत व्यक्तिगत भ्रूण पृथक. विकास में इस स्तर पर, भ्रूण पार्श्विका जर्दी थैली, जो deciduum ऊतक, आंत की जर्दी थैली और amnion संपर्क से घिरे रहे हैं amnion एक पारदर्शी झिल्ली है कि भ्रूण के साथ सीधे संपर्क में है. आंत की जर्दी थैली amnion और पार्श्विका जर्दी थैली के बीच स्थित है और आसानी से प्रमुख रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति है कि भ्रूण पोषण के द्वारा E8.5 - E9.5 भ्रूण में प्रतिष्ठित है. अपने आसपास की झिल्ली से प्रत्येक भ्रूण निकालें और एक नया विच्छेदन मीडिया युक्त अतिरिक्त रक्त निकालने की थाली में व्यक्तिगत हस्तांतरण. विकास मंच के भ्रूण से भ्रूण और litters के बीच भिन्न हो सकते हैं, प्रतिनिधि E8.5 भ्रूण और एक प्रतिनिधि E9.5 भ्रूण चित्रा 1D में दिखाए जाते हैं.
- 1.5 मिलीलीटर Eppendorf विच्छेदन मीडिया (ऊपर चरण 4 में वर्णित) के 200 μl युक्त ट्यूब प्रत्येक भ्रूण स्थानांतरण.
2. पृथक भ्रूण के Homogenization
- प्रत्येक Eppendorf ट्यूब करने के लिए, 200 उल का एक मात्रा (DPBS 1X Dubbecco फास्फेट में पतला buffered खारा) Collagenase प्रकार द्वितीय की 20 इकाइयों में जोड़ें.
- धीरे से एक 37 डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन में 20 मिनट के लिए 100 rpm पर नमूने हिला.
- अच्छी तरह से करने के लिए कक्षों की clumps को बाधित pipetting द्वारा Resuspend.
- बाँझ कक्ष (40 सुक्ष्ममापी जाल आकार) झरनी एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब पर रखा के शीर्ष पर सेल निलंबन लागू करें.
- तुरंत कमरे के तापमान सेल झरनी के शीर्ष पर 1X DPBS के 600 μl लागू करने के लिए जुदाई पूरा. झरनी त्यागें.
- 4 में नमूने अपकेंद्रित्र ° 5 मिनट के लिए 4000 XG में सी.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- आरटी 1X DPBS के 1 मिलीलीटर में गोली Resuspend.
- आरटी पर 1 मिनट के लिए 4000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- आरटी विच्छेदन मीडिया के 200 μl में गोली Resuspend.
- भ्रूण कोशिकाओं की गणना. औसतन 3-5 6 x 10 cells/E8.5 भ्रूण है.
3. क्रॉस - लिंक chromatin
- 1% formaldehyde के अंतिम एकाग्रता के लिए 200 μl नमूने के 37% formaldehyde के 5.6 μl जोड़ें.
- आरटी से कम 10 मिनट के लिए नमूनों को सेते हैं.
- ° 4 में 3 मिनट के लिए 4000 XG पर सी नमूने अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- ठंड 1X DPBS युक्त 80 μl / मिलीलीटर protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल (पीआईसी) के साथ कोशिकाओं Resuspend.
- 4 में नमूने अपकेंद्रित्र ° C 3 मिनट के लिए 4000 XG पर.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें. इस चरण में, नमूने -80 में जमे हुए किया जा सकता डिग्री सेल्सियस कई महीनों के लिए जमे हुए, Crosslinked नमूने स्थिर रहे हैं.
4. Sonication
- आरटी एसडीएस lysis बफर (50 मिमी Tris (8.1 पीएच) एचसीएल, 10 मिमी EDTA और 1 μl PIC/800 μl कुल मात्रा में ताजा जोडी तस्वीर के साथ 1% एसडीएस) 100 μl में सेल गोली Resuspend. जब resuspended, आरटी एसडीएस lysis बफर का एक अतिरिक्त 100 उल resuspension को बढ़ावा देने के जोड़ें. Pipetting और उलटा द्वारा अच्छी तरह मिक्स.
- 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेल निलंबन सेते हैं.
- 200 और 500 के बीच एक Diagenode Bioruptor का उपयोग basepairs कतरनी डीएनए lysed कोशिकाओं Sonicate UCD200 ™ (5 मिनट x 8 समय: 30 सेकंड on/30 सेकंड के आयाम उच्च शक्ति (320 वाट) पर बंद सेटिंग). नमूने एक बर्फ गारा से घिरा हुआ होना चाहिए. नमूने 4 ° C से ऊपर गर्म करने के लिए या करने के लिए फ्रीज करने की अनुमति न दें. वहाँ के कई प्रकार के उपलब्ध sonicators हैं. Sonication शर्तों प्रत्येक sonicator के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए पार से जुड़े डीएनए के लगभग 500 बीपी की लंबाई करने के लिए बाल काटना में परिणाम.
- 4 में sonicated नमूने अपकेंद्रित्र ° C 10 मिनट के लिए 14000 XG पर.
- टीएक ताजा Eppendorf ट्यूब बर्फ पर पूर्व ठंडा में सतह पर तैरनेवाला ransfer.
- 5 aliquots की एक अधिकतम में sonicated नमूना फूट डालो. हम empirically निर्धारित किया है कि एक भ्रूण E8.5 5 aliquots में विभाजित किया जा सकता है. छोटे या बड़े नमूना आकार के अनुसार बढ़ाया जा सकता है है. इस चरण में, नमूना -80 पर संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग.
- रिजर्व -20 ° C चरण 6 तक जब पार लिंक उलट हो जाएगा पर इनपुट और दुकान के रूप में उपयोग के लिए एक विभाज्य. अन्य चिप कमजोर पड़ने बफर (16.7 Tris - एचसीएल मिमी (8.1 पीएच), 1.2 मिमी EDTA, 1.1% ट्राइटन X-100, 167 मिमी NaCl और 0.01% एसडीएस) में 10 गुना aliquots μl/800 1 हौसले से जोड़ा तस्वीर युक्त पतला μl बफर.
5. प्री - समाशोधन और immunoprecipitation
- सामन - शुक्राणु डीएनए / प्रोटीन 4 पर एक या जी agarose 50% घोल ° सी रोटेशन के साथ, 1 घंटे के लिए 75 μl के साथ प्री - साफ पतला सतह पर तैरनेवाला. एक या प्रोटीन जी मोती एंटीबॉडी चिप के लिए इस्तेमाल किया जा द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए या तो प्रोटीन का प्रयोग करें. उदाहरण के लिए, प्रोटीन एक मोती खरगोश एंटीबॉडी के लिए सिफारिश कर रहे हैं, जबकि प्रोटीन जी मोती बकरी एंटीबॉडी या माउस आईजीजी 1 एंटीबॉडी के लिए सिफारिश कर रहे हैं . अधिक विस्तृत जानकारी के लिए, मनका निर्माता द्वारा की गई सिफारिशों को देखें.
- 4 ° C में 1 मिनट के लिए 2500 XG पर अपकेंद्रित्र.
- एक नया, पूर्व ठंडा Eppendorf ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
- विभाज्य पूर्व मंजूरी दे दी एंटीबॉडी (4 μg / नमूना) जोड़ें और 4 में रात सेते ° रोटेशन के साथ सी.
6. वॉशिंग chromatin प्रोटीन परिसर मनका
- प्रत्येक शीशी और 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस रोटेशन के साथ सेते 4 बजे में सामन शुक्राणु / डीएनए प्रोटीन एक या जी agarose घोल का 60 μl जोड़ें. वही मनका ऊपर 3 कदम में पूर्व समाशोधन के लिए इस्तेमाल किया प्रकार का उपयोग करें.
- 4 ° C में 1 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और त्यागें. बर्फ पर डीएनए प्रोटीन परिसर मनका रखें.
- Resuspend और धोने के रूप में नीचे धोने 1 बफ़र्स, 2 के साथ निर्देशित गोली, 3, और 4. बफ़र्स 4 से 1-3 ठंडा डिग्री सेल्सियस और इन buffers के साथ washes 4 में प्रदर्शन किया जाना चाहिए किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस धो धो 4 बफर इस बफर के साथ कमरे के तापमान और washes पर कमरे के तापमान पर प्रदर्शन होना चाहिए. प्रत्येक धोने उचित तापमान पर रोटेशन के साथ 5 मिनट के लिए है. प्रत्येक धोने अपकेंद्रित्र, 4 ° 1 मिनट के लिए 1000 XG में सी (धोने बफर 4 washes के लिए कमरे के तापमान) के बाद, तो ध्यान aspirate या सतह पर तैरनेवाला हटायें.
1 बफर: कम नमक धोने (बफर 20 Tris - एचसीएल मिमी (8.1 पीएच), 2 मिमी EDTA,% 1 X-100 ट्राइटन,
150 मिमी NaCl और 0.1% एसडीएस), 1 मिलीलीटर x 2 washes.
बफर 2: उच्च नमक (धोने बफर 20 मिमी (8.1 पीएच) Tris - एचसीएल, 2 मिमी EDTA, ट्राइटन% 1 X-100,
500 मिमी NaCl और 0.1% एसडीएस), 1 मिलीलीटर x 2 washes.
3 बफर: LiCl नमक धोने बफर (10 Tris - एचसीएल मिमी (8.1 पीएच), 1 मिमी EDTA, 1% IGEPAL CA630,
0.25 एम LiCl और 1% deoxycholic (सोडियम नमक) एसिड), 1 मिलीलीटर x 1 धोने.
4 बफर ते बफर (10 मिमी (8.1 पीएच) Tris - एचसीएल, 1 मिमी EDTA), 1 मिलीलीटर x 2 washes.
7. परिसर chromatin एंटीबॉडी के Elution
- हौसले से तैयार elution बफर (1% एसडीएस, 0.1 एम 3 NaHCO) के 250 μl में धोया है chromatin प्रोटीन मनका जटिल Resuspend. 5 सेकंड के लिए सख्ती से नमूना भंवर, तो आरटी पर रोटेशन के साथ 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- आरटी पर 1 मिनट के लिए 2500 XG पर अपकेंद्रित्र और एक नया Eppendorf ट्यूब में eluate हस्तांतरण.
- चरण 1 और 2 दोहराएँ और एक ही Eppendorf ट्यूब में eluates गठबंधन. eluates कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए. इस कदम के पूरा होने पर, जब तक आगे उपयोग eluates -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
8. रिवर्स क्रॉस - लिंक और डीएनए पुनर्प्राप्त
- 500 μl eluate (40 / इनपुट नियंत्रण के लिए μl मिलीलीटर) के लिए 20 μl 5 एम NaCl जोड़ें.
- 65 में डिग्री सेल्सियस 4 घंटा के लिए रात भर के लिए एक पानी के स्नान में eluates हीट.
- प्रत्येक नमूना (इनपुट नियंत्रण सहित) के 10 μl 2% agarose जेल आकार 0,1 करने के लिए 1 KBP फैले डीएनए टुकड़ा आकार की जाँच मार्करों के लिए अगले पर चलाया जा सकता है. डीएनए एक धब्बा के रूप में दिखाई देगा और नहीं एक तेज बैंड. नमूने के बाकी 65 में छोड़ दिया जा सकता है डिग्री सेल्सियस, जबकि जेल चल रहा है.
- प्रत्येक QIAquick जेल निकालना किट (Qiagen) का उपयोग नमूना से डीएनए पुनर्प्राप्त. QIAquick स्पिन स्तंभ और एक 500 μl नमूना में 200 isopropanol μl में सिलिका झिल्ली के साथ डीएनए सोखना अनुकूलन 600 μl Qg बफर (किट में आपूर्ति) जोड़ें. ध्यान दें कि Qg बफर पीएच सूचक नमूना के पीएच की आसान दृढ़ संकल्प की अनुमति शामिल है. यदि नमूने का रंग बैंगनी रंग के लिए पीले रंग से बदल जाता है (पीएच 7.5) के मिश्रण के बाद, नमूना और मिश्रण करने के लिए 10 3 एम NaAcetate के μl (5.2 पीएच) को जोड़ने. इस स्तंभ में मोतियों के लिए बाध्य डीएनए को अधिकतम करने के मिश्रण के पीएच कम कर देता है.
- पहले स्तंभ लोड हो रहा है करने के लिए, मिश्रण की जांच के लिए तय है कि किसी भी एसडीएस वेग मौजूद है. यदि एसडीएस तेज़ी हुई है, नमूना एक में गर्म किया जाना चाहिए42 ° सी पानी के स्नान तक वेग गायब हो जाता है.
- QIAquick स्पिन स्तंभ (बैंगनी किट में स्तंभ) में मिश्रण की 700 μl लोड और 1 मिनट के लिए 14000 XG पर आरटी पर अपकेंद्रित्र. आगे बढ़ने से पहले स्तंभ के माध्यम से प्रवाह को त्यागें और नमूने के शेष के साथ इस कदम दोहराएँ.
- 500 μl Qg बफर जोड़ें स्तंभ धोने. आरटी पर 2 मिनट के लिए 14000 XG पर अपकेंद्रित्र. आगे बढ़ने से पहले स्तंभ के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
- पीई धोने बफर के 700 μl (किट में आपूर्ति) जो इथेनॉल निर्माता द्वारा निर्देश के रूप में जोड़ा गया है के साथ स्तंभ धो लें. आरटी पर 1 मिनट के लिए 14000 XG पर अपकेंद्रित्र. आगे बढ़ने से पहले स्तंभ के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
- पूरी तरह से स्तंभ से पीई बफर के शेष निकालने centrifugation चरण को दोहराएँ. के माध्यम से प्रवाह और संग्रह ट्यूब त्यागें.
- 60 μl EB बफर (elution बफर किट में आपूर्ति) जोड़ने के द्वारा एक ताजा Eppendorf ट्यूब में स्तंभ से Elute डीएनए.
- कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 14000 XG पर अपकेंद्रित्र. eluted डीएनए का पता लगाने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. बरामद माल की एक 260 रीडिंग्स आमतौर पर 90-120 एनजी / उल की सांद्रता ~ विभाज्य प्रति 6-7 स्नातकीय की कुल वसूली के लिए संकेत मिलता है . हालांकि, इन नमूनों की 260/280 अनुपात आम तौर पर> 1.8, सुझाव है कि शाही सेना के नमूने में मौजूद है. इस प्रकार बरामद डीएनए की सही मात्रा कम हो सकता है.
9. बरामद डीएनए का विश्लेषण
- एसडीएस पीसीआर Taq पोलीमरेज़ की गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. एसडीएस पीसीआर प्रदर्शन से पहले पूरी तरह हटाया जाना चाहिए. बर्फ पर डीएनए सेते हैं 1 मिनट के लिए 14000 XG पर किसी भी अवशिष्ट एसडीएस और अपकेंद्रित्र 4 ° C वेग. एक नई Eppendorf tube.This कदम स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला पुरजोर सिफारिश की है.
- डीएनए eluates पारंपरिक पीसीआर या मात्रात्मक प्रत्येक अनुक्रम के लिए विश्लेषण किया जा के लिए विशिष्ट प्राइमरों के साथ वास्तविक समय पीसीआर (क्यू पीसीआर) के द्वारा या तो पाया जा सकता है. कुल डीएनए eluate से 5-10 μl एक पीसीआर या Q-पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इनपुट नियंत्रण के साथ पीसीआर अन्य नमूनों की राशि के साथ तुलना में डीएनए के एक 5-10 गुना कमजोर पड़ने के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है. पीसीआर और क्यू - पीसीआर स्थितियों में भिन्नता है, लेकिन प्रारंभिक सामग्री की सीमित मात्रा में अतिरिक्त पीसीआर चक्र की आवश्यकता है. पारंपरिक पीसीआर का पता लगाने के लिए, हम 40 चक्र के साथ शुरू करने और जरूरत के रूप में समायोजन करने की सलाह देते हैं.
10. प्रतिनिधि परिणाम
हम इस प्रोटोकॉल से दोनों E8.5 और E9.5 भ्रूण (चित्रा 2) चिप प्रदर्शन का इस्तेमाल किया है. परिणाम दर्शाते हैं कि myogenin E8.5 और E9.5 भ्रूण में myogenin प्रमोटर पर मौजूद है. चिप शुद्ध DNAs पारंपरिक (पीसीआर 2A चित्रा) और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (चित्रा 2B) द्वारा विश्लेषण किया गया. इसके विपरीत, वहाँ जर्दी थैली, जहां myogenin नहीं व्यक्त की है में myogenin प्रमोटर के लिए बाध्य myogenin के कोई संकेत नहीं था. इंटरफेरॉन-γ (IFNγ) प्रमोटर, जिसमें myogenin बाध्यकारी साइट मिलान दृश्यों एक नकारात्मक अनुक्रम नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. जैसी कि उम्मीद थी, myogenin ऊतक परीक्षण नमूनों में से किसी में IFNγ प्रमोटर के लिए बाध्य नहीं किया गया था. , जो कंकाल की मांसपेशी के लिए व्यापारियों हैं, E8.5 और 9.5 भ्रूण में, myogenin (6,10 चित्रा 3) somites में विशेष रूप से व्यक्त किया है. इस प्रकार परिणामों से संकेत मिलता है कि myogenin E8.5 और E9.5 पर somites में myogenin प्रमोटर के लिए बाध्य है.
चित्रा 1 E8.5 भ्रूण विच्छेदन. (ए) आइसोलेटेड गर्भाशय सींग (शीर्ष पैनल, उच्च कम पैनल में दिखाया बढ़ाई). (बी) गर्भाशय सींग कैंची से काट व्यक्तिगत आरोपण व्यक्तिगत भ्रूण वाली साइटों को अलग. (सी) भ्रूण विच्छेदन के दौरान गर्भाशय के ऊतकों से उभड़नेवाला. तीर अभी भी अतिरिक्त भ्रूण ऊतक के द्वारा कवर किया भ्रूण निशान. (डी) दो एक ही कूड़े से E8.5 भ्रूण. बाईं तरफ के भ्रूण निर्णायक की प्रक्रिया शुरू नहीं हुई है. दाईं तरफ भ्रूण मोड़ के दौर से गुजर रहा है. सुदूर सही - प्रतिनिधि E9.5 भ्रूण.
चित्रा 2 चिप परख E8.5 और E9.5 भ्रूण में myogenin प्रमोटर के लिए बाध्य myogenin प्रदर्शन.. (शीर्ष) डीएनए के 5 उल चिप एक myogenin एंटीबॉडी या गैर विशिष्ट आईजीजी प्राइमरों कि प्रतिलेखन की शुरुआत साइट पर myogenin प्रमोटर के एक भाग -79 से 69 रिश्तेदार बढ़ाना के साथ प्रदर्शन किया गया था का उपयोग कर प्रयोगों से शुद्ध की परम्परागत पीसीआर विश्लेषण है कि एक myogenin बाध्यकारी -12 या प्राइमरों कि IFNγ प्रमोटर कि एक अनुक्रम मिलान myogenin बाध्यकारी साइट स्थित ~ प्रतिलेखन शुरू साइट के 1075 बीपी अपस्ट्रीम होता है के एक हिस्से को बढ़ाना पर स्थित साइट शामिल हैं. IFNγ प्राइमर इस्तेमाल किया अनुक्रम 5'-GCT थे GAC TCA आगा सीसीसी GGC-3 CGA 'और 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3'. (नीचे) मात्रात्मक ही (ए) में इस्तेमाल किया के नमूनों की वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण.मानक विचलन - डेटा + / इनपुट के% के रूप में प्लॉट किए जाते हैं.
चित्रा 3 Myogenin विशेष रूप से E8.5 और E9.5 भ्रूण somites में व्यक्त किया है. Myogenin स्वस्थानी संकरण में पूरा माउंट somites में विशिष्ट mRNA अभिव्यक्ति से पता चलता है. - E8.5 छवि 200 सुक्ष्ममापी में आकार बार. E9.5 छवि में आकार बार - 500 सुक्ष्ममापी.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
वर्णित चिप प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि myogenic नियामक myogenin कंकाल की मांसपेशी अग्रदूत एकल E8.5 और E9.5 भ्रूण में मौजूद ऊतकों में myogenin प्रमोटर के साथ जुड़ा हुआ है. पूर्व अध्ययनों से बड़े पैमाने पर ई बॉक्स युक्त दृश्यों के लिए बाध्य myogenin विशेषता है इन विट्रो जेल शिफ्ट प्रयोगों इन विट्रो अनुवादित या bacterially उत्पादन myogenin और radiolabeled लक्ष्य जीन विनियामक 11-20 दृश्यों के प्रासंगिक भाग एन्कोडिंग डीएनए में उपयोग में प्रारंभिक शुरुआत के साथ. परम्परागत चिप अध्ययन myogenesis 21-24 के लिए टिशू कल्चर मॉडल में myogenin प्रमोटर के लिए बाध्य myogenin दिखा दिया है . हालांकि, वहाँ कोई सबूत नहीं है कि यह दर्शाता है कि myogenin भ्रूण कंकाल की मांसपेशी विकास के दौरान myogenin प्रमोटर बांधता है, हालांकि इस मामले में हो embryogenesis में बाद में myogenin myogenin से E15.5 जीभ ऊतक में मनाया अभिव्यक्ति के नीचे विनियमन पर आधारित भविष्यवाणी सकता है कमी चूहों 25. इस प्रकार डेटा सबूत है कि myogenin और myogenin प्रमोटर बातचीत के बीच बातचीत vivo में होता है प्रदान करता है. इस तकनीक का एक स्पष्ट आवेदन करने के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए पूर्व अध्ययन की शारीरिक प्रासंगिकता निस्र्पक ऊतक विशेष जीन सक्रियण ऊतक संस्कृति मॉडल का उपयोग किया सत्यापित है. अधिक दिलचस्प आवेदन करने के लिए एक नए या पहले से uncharacterized टिशू कल्चर कार्यात्मक mechanisms.The प्रोटोकॉल समझ में डिजाइन के अध्ययन के प्रदर्शन से पहले एक विशेष बातचीत की शारीरिक प्रासंगिकता का निर्धारण कारक के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के एक भाग के रूप में इस तकनीक का उपयोग भी इस्तेमाल किया जा सकता है chromatin माउस मॉडल में विशिष्ट विकासात्मक चरणों जिसमें एक इंजीनियर आनुवंशिक हेरफेर पर होने वाली बातचीत: सीधे प्रोटीन की तुलना.
हम आशा करते है कि इस पद्धति का भी समय ऊतक विकास के दौरान विशिष्ट जीन विनियमन के पाठ्यक्रम के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा. विशिष्ट कारक का आकलन करके: विभिन्न चरणों में भ्रूण chromatin बातचीत, एक समय बिंदु पर जो कारक बातचीत पहली बार होता है की पहचान सकता है, चाहे बातचीत भर और भेदभाव प्रक्रिया से बाहर रखा गया था या प्रकृति में और अधिक क्षणिक था निर्धारित करते हैं, और कर सकता है निर्धारित सकता है कारक बंधन के आदेश अगर कई कारकों एक विशिष्ट अनुक्रम के साथ बातचीत. अंत में, हम कल्पना है कि प्रोटोकॉल फिर चिप 26 प्रक्रिया है जिससे chromatin immunoprecipitation एक से बरामद एक एंटीबॉडी के साथ एक अलग कारक के खिलाफ सह chromatin के एक ही टुकड़े कब्जे माना जा रहा में एक दूसरे immunoprecipitation के अधीन है करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. फिर चिप प्रोटोकॉल और अधिक निर्णायक सबूत है कि दो अलग कारकों chromatin का एक ही टुकड़े पर मौजूद हैं प्रदान करता है, इस संशोधन के लिए जाने की संभावना आवश्यकता सामग्री शुरू की राशि में वृद्धि होगी.
एक उल्लेखनीय अहसास है कि हमारे प्रयासों से आया था कि सामग्री शुरू की सीमित मात्रा में सफलता के लिए बाधा है कि एक, भविष्यवाणी हो सकता है विशेष रूप से दी है कि टिशू कल्चर सेल आधारित प्रोटोकॉल अक्सर लाखों या की लाखों की दसियों की एक सजातीय जनसंख्या के साथ शुरू सुझाव है नहीं था 26,27 कोशिकाओं. हमारे प्रयासों की सफलता जांच के तहत कारक के विशिष्ट immunoprecipitation में सक्षम एंटीबॉडी के लिए प्राथमिक आवश्यकता है (और अक्सर बेकाबू) के लिए बोलती है. एक बार एक एंटीबॉडी immunoprecipitation में सक्षम के रूप में पहचान की है, अन्वेषक एंटीबॉडी की राशि इस्तेमाल किया titrating चिप परख का अनुकूलन कर सकते हैं. यह नोट करना महत्वपूर्ण है और हमेशा बेहतर नहीं है, हम अक्सर है कि सीमित मात्रा, उच्च अप्रासंगिक दृश्यों के लिए बाध्य पृष्ठभूमि में परिणाम के नमूनों के साथ विशेष रूप से बहुत अधिक एंटीबॉडी मिल जाए,. इसके अलावा, immunoglobulin भिन्न या आत्मीयता शुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग अक्सर कम पृष्ठभूमि में परिणाम से antisera का उपयोग करता है. नियंत्रण एंटीबॉडी से पृष्ठभूमि अक्सर एक नमूना सहित किसी भी एंटीबॉडी के बिना मोतियों से युक्त द्वारा लगाया जा सकता है.
हम निष्कर्ष है कि विकास के संदर्भ में सीधे चिप विश्लेषण के लिए प्रोटीन के प्रारंभिक चरण भ्रूण का उपयोग: chromatin कि बातचीत ऊतक विशिष्ट जीन की सक्रियता के दौरान होते प्रेरण और ऊतक विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति कार्यक्रम के रखरखाव में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करने की क्षमता है .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
जानवरों पर प्रयोगों मैसाचुसेट्स मेडिकल स्कूल IACUC के विश्वविद्यालय द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस काम आईएएनएस, जो अमेरिकी रिकवरी और पुनर्निवेश अधिनियम 2009 के माध्यम से सम्मानित किया धन शामिल R01 GM56244 NIH द्वारा समर्थित किया गया था, और R01 GM87130 NIH द्वारा JARP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
| Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
| Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, Suppl 1. 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
