Fotoblekning tester (FRAP & Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Summary

Vi beskriver fotoblekning metoder inklusive fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och fluorescens Förlust i fotoblekning (Flip) för att övervaka kromatin protein dynamik i embryonala stamceller (ES-celler). Kromatin protein dynamik, vilket anses vara ett av sätten att studera kromatin plasticitet, är förstärkt i pluripotenta celler.

Abstract

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) och fluorescens Förlust i fotoblekning (Flip) gör det möjligt att studera proteiner dynamik i levande celler med god rumslig och tidsmässig upplösning. Här beskriver vi hur du utför FRAP och FLIP analyser av kromatin proteiner, inklusive H1 och HP1 i möss embryonala stamceller (ES-celler). I en FRAP experiment celler transfekterade, antingen tillfälligt eller stabilt, med ett protein av intresse smält med grönt fluorescerande protein (GFP) eller derivat därav (YFP, GFP, Cherry, etc.). I transfekterade, fluorescerande celler, blekmedel ett intensivt fokuserad laserstråle en relativt liten region av intresse (ROI). Lasern våglängd väljs enligt den fluorescerande protein som används för fusion. Laserljuset oåterkalleligen bleker den fluorescerande signal molekyler i ROI, och omedelbart efter blekning, återhämtning av fluorescerande signalen i blekt området - medierad av utbyte av blekt molekyler med oblekt molekyler - övervakas med hjälp av bildbehandling tid förfaller. Den genererade fluorescens återhämtning kurvor ger information om proteinets rörlighet. Om den fluorescerande molekyler är orörliga, kommer ingen fluorescens återhämtning observeras. I en kompletterande strategi, Fluorescens Förlust i fotoblekning (Flip), blekmedel laserstrålen på samma ställe upprepade gånger och signalen intensitet mäts på andra håll i fluorescerande celler. FLIP experiment mäter alltså signalen förfall snarare än fluorescens återhämtning och är användbara för att bestämma protein rörlighet samt protein skytteltrafik mellan cellulära utrymmen. Övergående bindning är en gemensam egendom för kromatin-associerade proteiner. Även om större del av varje kromatin protein är bundet till kromatin i varje ögonblick vid steady state är bindande övergående och mest kromatin proteiner har en hög omsättning på kromatin, med en uppehållstid i storleksordningen sekunder. Dessa egenskaper är avgörande för att generera hög plasticitet i genomet uttryck ^1. Fotoblekning experiment är därför särskilt lämpligt att bestämma kromatin plasticitet med hjälp av GFP-fusion versioner av kromatin strukturella proteiner, särskilt i ES-celler, där den dynamiska utbyte av kromatin proteiner (inklusive heterochromatin protein 1 (HP1), länkare histon H1 och histoner kärna) är högre än i differentierade celler ^2,3.

Protocol

1. Plätering av ES-celler

T = 0 timmar
MEF plätering

1. Täck Bildproduktion 8-brunnars μ-bilder (ibidi, München, Tyskland) med gelatin eller i chambered täckglas (Lab-Tek, Rochester, NY) eller i glas-botten kultur rätter (Mattek, Ashland, MA). Låt stå i 5-30 minuter och aspirera bort den fria gelatin.
2. Seed 22.000 MEFs / brunn i 250 l totala volymen av DMEM [kompletterad med 10% fetalt bovint serum (FBS)]. Låt cellerna att växa i en vävnadsodling inkubator (37 ° C, 5% CO2).

T = 6 timmar
ES-celler plätering

3. Aspirera DMEM.
4. Seed varje MEF belagda väl med 15.000 R1 celler / brunn i 250 l totala volymen av ES-celler media [kompletterad med 10% ESC-grade fetalt bovinserum (FBS), 1 mm natrium pyruvat, 0,1 mM oväsentliga aminosyror, 0,1 mM β- merkaptoetanol, och 1000 U / ml leukemi hämmande faktor (LIF)], för att erhålla 30% till 50% sammanflödet följande dag.

2. Transfecting de ES-celler

T = 24 timmar
Övergående transfektion

1. Byt media ES-celler med 250 l / brunn av färska ES-celler media.
2. I ett 1,5 ml sterilt provrör, tillsätt 100 l serum fria medier [Opti-MEM (Gibco)], lägg sedan till 10 l Transit-LT1 transfektion reagens (Mirus) direkt i serum fria medier. Blanda genom försiktig pipettering och inkubera i rumstemperatur i 5-20 min.
3. Lägg till 1,5 mikrogram GFP fusion plasmid-DNA (H1e, H1o eller HP1) för att den utspädda transit-LT1 reagens. Blanda genom försiktig pipettering och inkubera i rumstemperatur i 15-30 min.
4. Lägg till 13,5 l / brunn av transfektion blandningen. Snurra på 8-brunnars μ-bilder för att säkerställa jämn spridning. Efter 24 timmar ersätta de gamla medierna ES-cell med 250 l färska medier ES-celler.

3. Utföra FRAP och FLIP

T = 48-72 timmar

1. Experimentet kan utföras på alla konfokala laserskanning mikroskop (CLSM) men eftersom i en normal FRAP / FLIP experimentet är många bilder i följd förvärvade, rekommenderas att använda en snurrande-disk konfokalmikroskop, vilket möjliggör förvärv hastighet och garanterar att inga oönskade prov blekning kommer att ske efter den första avsiktligt blekning händelse. Här rekommenderar vi att du använder revolutionen spinning disk konfokala system (www.Andor.com), med Yokogawa CSU-X spinning disk huvudet. Detta system har den dubbla kapaciteten att photobleach med hjälp av en specialiserad FRAPPA modul med en punkt scanning system, och att snabbt växla ljuset tillbaka för att samla in bilder med den snurrande skivan. De 3 vanligaste fluorescerande proteiner som används för fotoblekning experiment GFP, YFP och Cherry. Om GFP eller YFP används är en ~ 488 nm laser krävs. För Cherry, använd en ~ 560 nm laser. I alla fall rekommenderar vi att du använder solid state laser. Med en automatiserad skede är användbart men inget krav. Eftersom levande celler är avbildade är det viktigt att använda en klimatkammare (vi använder en från LIS, Schweiz), kontrollera syre, fukt, CO ₂ och temperatur. FRAP utförs med maximal laser intensitet samtidigt avbildning görs med minimal krävs lasereffekten (oftast inom 10%, när fluorescens nivån är tillräcklig).
   Observera cellerna med fluorescerande ljus av lämplig våglängd och markera en cell som uttrycker GFP med ett 60X-objektiv oljeimmersion. Se till att rätt subcellulära distribution. Ibland, när uttrycket nivåerna är för höga, kan proteinets lokalisering "spill" till andra avdelningar, såsom kärnsystemet. Sådana celler bör inte väljas.
2. Nu som en bildprotokoll: samla in 3-5 bilder innan fotoblekning, sedan photobleach på euchromatin eller heterochromatin (ses som kondenseras GFP foci) och samla 90-120 ramar efter photobleach med 250-1000 ms intervall: H1e-GFP, 1000 ms, H1o och HP1-GFP, 250 ms (intervall tiden ändras beroende på proteinet dynamik, där mycket dynamisk proteiner kräver kortare intervall tid). Vi använder normalt 80-100% laser intensitet under fotoblekning med en laserpuls med 20-40 μseconds (1-2 iterationer), men dessa siffror kan ändras beroende på analyserade protein och nivåerna uttryck. När fotoblekning är lämpligt, bör du följa ett "svart hål" i din GFP fluorescens. Det svarta hålet är gradvis åter fylld med fluorescens efter tillfrisknandet. Även om den snurrande skivan kan få upp till cirka 60 bilder per sekund (med bra fluorescensintensitet och när du zoomar in på en enda cell), rekommenderar vi inte använder systemet på så höga hastigheter på grund av låg bildkvalitet och potentiellt ökad fototoxicitet.
3. För en FLIP experiment inrätta en annan bildprotokoll: samla in 3-5 bilder innan blekning, sedan börja upprepade blekning på samma plats samtidigt samla in bilder. För H1e-GFP, blekmedel var 5 sek, för H1o-GFP, blekmedel varje 2 sek, och för HP1-GFP blekmedel varje 1 sek. Bleach ettd samla in bilder flera gånger under hela experimentet.
4. För antingen tekniken, upprepa processen på 20-30 celler. För statistiska ändamål, upprepa försöket tre gånger eller mer, helst på olika dagar. I homogena befolkningar och korrekta inställningar, är standardavvikelsen vanligtvis låg (<5%).
   För både FRAP och FLIP, påverkar storleken och formen på blekt regionens återhämtning dynamik och måste vara konstant inom ett experiment. Dessutom, när två celler jämförs, måste samma protokoll användas och cellerna måste analyseras i följd på samma dag som power laser och andra villkor kan variera och kan påverka resultatet av experimentet.

4. FRAP och FLIP dataanalys

1. I alla FRAP ramar in, mäta fluorescens intensiteten i ROI (ROI _B = blekt område), bakgrunden område (ROI _BG), och den icke-blekt nukleära området (ROI _nb) som funktion av tiden före och efter blekning. När blekt regionen är försumbar hela kärna kan väljas för normalisering ändamål.
2. För varje tidpunkt, normalisera data enligt formeln: (ROI _b - ROI _BG) / (ROI _NB - ROI _BG) / (pbROI _b - pbROI _BG) / (pbROI _NB - pbROI _BG), betecknar pb pre-blekt. För pre-bleka avbilder du bör hämta ett värde av cirka 1. Den första bilden efter den bleka kommer att ange Bleach djup. Subtrahera värdet från 1 för det faktiska Bleach djup värde. Upprepa för varje cell och i genomsnitt 20-30 celler från varje försök.
3. I alla insamlade FLIP ramar mäta fluorescens intensiteten i det icke-blekt nukleära området, och bakgrunden område (ROI _NB = icke-blekt område, ROI _BG = bakgrund). Beräkning av FLIP uppgifter liknar en FRAP kurva, bör endast de analyserade ROI (ROI _nb) vara annorlunda än det faktiska blekta regionen, som inte används för beräkning: (ROI _NB - ROI _BG) / (pbROI _NB - pbROI _bg) . Det är också möjligt att använda en angränsande cell (ROI _n = granne cell) för normalisering syften: (ROI _NB - ROI _BG) / (ROI _n - ROI _BG) / (pbROI _NB - pbROI _BG) / (pbROI _n - pbROI _BG ).
   Efter insamling av data, är det möjligt att montera de experimentella data till datorsimulering. Detta gör det möjligt att beräkna, med en god närhet, den mobila delen, den orörliga fraktionen och halva maximum. Vi kommer inte att diskutera matematiska och statistiska aspekter av FRAP analyser här och hänvisar läsaren till andra utmärkta publikationer ^4-9. Det blekmedel djup är avståndet (på y-axeln) mellan före blekmedel (100%) signalen och den första bilden efter bleka, den mobila fraktionen är avståndet (på y-axeln) mellan blekmedel djup och de återvunna signal när kinetik når en platå, och den orörliga delen är avståndet (på y-axeln) mellan den återskapade signalen och före blekmedel (100%) signal (se diagram 1B och 2B). Utöver denna analys finns det goda matematiska modeller passar data. För en enda exponent ekvationen
   
   där t är tiden, är A den mobila fraktionen, 1-A är den orörliga fraktionen och k _Av är dissociationskonstant, kan användas för att passa data, och en direkt uppskattning av off graden av bindning (k _off) kan erhållits, samt för parametern A, som kan användas för att beräkna föreningen takt.

5. Representativa resultat:

Figur 1. A och B visar representativa kurvor FRAP av HP1 (vänster), H1o (mitten) och H1e (höger) i R1 ES-celler. För enkelhet och tydlighet Figur 1A visar rådata i en enda cell innan normalisering och beräkning. Den gula kurvan motsvarar blekt regionen motsvarar den lila kurvan till den icke-blekt nukleära området (när blekt regionen är försumbar hela kärna kan väljas för normalisering ändamål), och den röda linjen motsvarar den bakgrunden fluorescens, vilket är minimal i detta fall. Vertikal pil representerar blekmedel tiden. Normaliserats och genomsnitt data visas i figur 1B. Notera långsammare återhämtning av H1 (blå) jämfört med HP1 (röd). Även H1e varianten (mörkblå) är långsammare än H1o varianten (ljusblå). Mobil och orörlig fraktioner och Bleach djup är indicerat för HP1.

Figur 2. A-och B visar representativa kurvor FRAP jämföra euchromatin (vänster) med heterochromatin (höger) för HP1 i R1 ES-celler. I likhet med Figur 1 visar figur 2A rådata i en enda cell, motsvarar gula kurvan till blekt regionen motsvarar lila kurvan till den icke-blekt nukleära området, och den röda linjen motsvarar bakgrundsfluorescens. Vertikal pil representerar blekmedel tiden. Normaliserats och genomsnitt data visas i Figur 2B. Notera långsammare återhämtning av heterochromatin (mörkröd) jämfört med euchromatin (ljusröd). Mobil och orörlig fraktioner och Bleach djup är indicerat för euchromatin.

Figur 3.. En typisk FLIP experimentet H1o R1 ES-celler visas i figur 3A (rå, FN-normaliserade data) och B (normaliserad och i genomsnitt data). I detta experiment den lila kurvan motsvarar den icke-blekt nukleära området, svarar den gröna linjen till en angränsande cellkärnan och den röda linjen motsvarar bakgrundsfluorescens.

Discussion

Skillnad från de flesta tillgängliga teknik, som innebär renade kromatin från cellpopulationer eller fasta celler, FRAP experiment följa förändringar i kromatin protein dynamik i levande celler. Vi fann kromatin protein dynamik att vara en god indikator för kromatin plasticitet. Men eftersom det kräver fixeringen genen av intresse med GFP kan tillägg av fluorescerande taggen störa proteinets funktion. Således, innan du fortsätter med FRAP måste fusionsproteinet vara rigoröst testade för att se till att den har samma egenskaper och funktion som dess naturliga motsvarighet. Guldmyntfoten skulle vara att komplettera den endogena proteinets funktion med GFP-fusion i en knockout cellinje. Men knockout cellinjer är inte alltid tillgängliga och i många fall proteinets frånvaro inte har en tydlig fenotyp. Ändå kan man testa fusion proteinets subcellulära distribution, dess uttryck nivå, dess bindande partners, alla jämfört med den endogena protein för att säkerställa korrekt partiell ersättning.

När verifieras, måste GFP fusionsproteinet vara transfekterade i ES-celler. Vi fann att Transit fungerar bra med ES-celler och uppnår transfektion effektivitet på över 50%. Övergående transfektion är bekvämt eftersom det tillåter fortsätter med experimentet direkt, men stabil transfektion är ofta överlägsen, säkerställa långsiktig överlevnad av celler i närvaro av fusionsprotein av intresse, och resulterar i lägre och ett homogent uttryck nivå. Ytterligare metoder för märkning proteiner med GFP taggar inkluderar GFP-genen taggning i alkoholkoncentrationerna med combineering ¹⁰ eller GFP-svällning endogena gener direkt med GFP / YFP exoner ^{11, 12.} Dessa metoder är att föredra, eftersom fusionsproteinet drivs av en endogen promotor, men inte alltid tillgänglig. Transfektion av alkoholkoncentrationerna i ES-celler är möjligt med standard transfektion metoder. Slutligen kan ES-celler från transgena möss som uttrycker taggade kromatinet proteinet också användas. Även mer omständligt, gör denna metod användningen av tidig passage celler, till skillnad stabilt transfekterade celler, som kräver långsiktig odling för att uppnå rena urval av stabil integration.

När proteinet av intresse har valts, smält med GFP, verifieras och transfekterade i ES-celler, det finns flera grundläggande villkor som måste uppfyllas för en lyckad FRAP experiment: det första måste den fluorescerande signal som skall blekas vara klart kan spåras över någon bakgrund signal, för det andra måste fotoblekning vara snabb i förhållande till period av återhämtning för att ge tillräcklig tidsupplösning för analys av återhämtningen kurvan och för att möjliggöra mätning av den halva tiden för återhämtning. Därför bör lasern används för blekning vara kraftfull nog för att tillåta detta, för det tredje måste övervakningen stråle ha låg intensitet för att minimera fotoblekning. En snurrande skiva konfokalmikroskop, utrustad med fotoblekning kapacitet (t.ex. Andor Revolution system), är därför idealisk för detta ändamål. Slutligen måste en klimatkammare hålla celler på ordentlig tillväxt villkor vara installerad på mikroskopet för att säkerställa korrekt cell homeostas.

En allvarlig begränsning när man analyserar kärna histoner är att de är tätt kopplade till DNA, och därför i FRAP experiment de verkar nästan orörlig. För att nå fullständig återhämtning av de grundläggande histoner bör FRAP kurvorna når flera timmar. Eftersom ES-celler är mycket rörliga i kulturen, är det i grunden tekniskt omöjligt att genomföra timmar långa FRAP experiment. För att undvika detta kan man göra upp till 10 experiment min FRAP och extrapolera den kinetiska beteende från minuter till timmar. I motsats till kärnan histoner, de flesta DNA-bindande proteiner associerar snabbt och separera från kromatin, vilket resulterar i korta halveringstider i storleksordningen sekunder till flera minuter som mest ^1. I denna uppsats har vi studerat två DNA-bindande proteiner, H1 och HP1, både dynamisk i ES-celler, men HP1 är mer dynamisk än H1 (se figur 1). Notera båda dessa kromatin proteiner är mindre dynamiska i heterochromatin än euchromatin, därför fluorescens återhämtning efter fotoblekning av heterochromatin är långsammare (som visas i figur 2). Den långsammare återhämtning i heterochromatin återspeglar sannolikt en högre koncentration av bindningsställen för H1 och HP1 samt molekylär trängsel.

Sammanfattningsvis, fotoblekning experiment ger möjlighet att studera kromatin protein dynamik i levande celler, vilket återspeglar kromatin plasticitet, som är överdriven i pluripotenta celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5671
Gelatin	Merck & Co., Inc.	1.04078
Opti-MEM	GIBCO, by Life Technologies	31985
TransIT-LT1	Mirus Bio LLC	MIR2300
8-well μ-Slides	ibidi	80826