Summary
מאמר זה מדגים שתי שיטות שונות של הזרקת מאוד: 1) לתוך המוח (intracerebroventricular) ו 2) מערכתית (תוך ורידי) כדי להציג את סוכני טיפולית לתוך מערכת העצבים המרכזית של עכברים הילוד.
Abstract
למרות תפקיד המגן כי מחסום הדם במוח משחקת מיגון המוח, שהוא מגביל את הגישה אל מערכת העצבים המרכזית (CNS), אשר לרוב תוצאות הכישלון של הרפוי פוטנציאליים מיועד 1,2 הפרעות ניווניות. מחלות ניווניות כגון ניוון שרירים השדרה (SMA), שבו הנוירונים המנוע נמוך יותר מושפעים, יכול להפיק תועלת רבה מן מציגה את סוכני טיפולית לתוך מערכת העצבים המרכזית. המטרה של הוידאו הזה היא להדגים שתי פרדיגמות שונות כדי לספק הזרקת חומרים טיפוליים לעכברים הילוד לאחר הלידה. אחת השיטות הללו הוא להזריק ישירות לתוך החדרים לרוחב מוחין (Intracerebroventricular) שתוצאתה העברת חומרים לתוך מערכת העצבים המרכזית באמצעות נוזל השדרה 3,4. השיטה השנייה היא הזרקה לווריד הזמני (תוך ורידי) שיכולים להציג הרפוי שונים לתוך מערכת הדם, המובילה משלוח מערכתית כולל מערכת העצבים המרכזית 5. התמרה נרחבת של מערכת העצבים המרכזית הוא בר השגה אם וקטור ויראלי המתאים סרוטיפ ויראלי מנוצל. ויזואליזציה וניצול של וריד להזרקה הזמני אינו ריאלי עד יום הלידה 6. עם זאת, אם את החומר נמסר מיועד להגיע CNS, זריקות אלו צריכות להתקיים בעוד מחסום דם מוח הוא חדיר יותר בשל המצב שלה לא בשלה, רצוי לפני יום הלידה 2. המוח מפותחת מחסום הדם מאוד מגביל את היעילות של מתן תוך ורידי. שתי מערכות אספקת הם פשוט ויעיל פעם כישרון כירורגית מושגת. הם אינם דורשים כל התקנים כירורגיים נרחבים יכול להתבצע על ידי אדם אחד. עם זאת, שיטות אלו אינן בלי אתגרים. גודלו הקטן של הלידה 2 גורים יום בתחומים הבאים יעד קטן יכול לעשות זריקות קשה לבצע ומאתגר בתחילה לשכפל.
Protocol
1. Intracerebroventricular הזרקה
- השלב הראשון הוא הכנת הפתרונות מניות זריקה; פתרונות אלה וקטור נגיפי, הדנ"א פלסמיד, סמים, וצריך להיות מוזרק בתנאים סטריליים.
- מערבבים titer הרצויה של וקטור ויראלי (סה"כ μL 5-7) עם 0.05% w / v trypan כחול PBS להדמיה של הזריקה.
- פתרון ה-DNA פלסמיד (5 בסך הכל אני μL) מכיל D-(+), גלוקוז 20% (w / v) (1 μL), trypan כחול (0.05%) PBS (1 μL), פלסמיד (~ 5 ~ g / L ~ ) (2 ~ L), ו -2.5 kDa ליניארי homopolymer PEI (150 מ"מ) (1 ~ L).
- לשתק את PND 2 בילודים באמצעות הרדמה-cryo במשך 1-2 דקות.
- מחט המשמש להזרקת זהו מיקרו ליטר מכויל micropipette זכוכית מעוקר כי מצורף מזרק 3ml 3 המילטון מ"ל דרך צינור ארוך.
- לשבור את קצה המחט (עם מרית) כדי להתאים את החדירה 2 מ"מ לתוך הגולגולת. מניחים את המחט באלכסון בצינור microcentrifuge המכיל את פתרון ההזרקה. טען הפתרון זריקה לתוך המחט בקפידה על ידי משיכת הבוכנה של המזרק.
- לאחר ספיגת הפתרון, לנתק את המזרק מהצינור, למשוך את הבוכנה עד נוספת ולאחר מכן לצרף את המחט שוב.
- החזק את המחט ביד ימין בין האגודל והאצבע והמקום מזרק בין האצבעות באמצע טבעת עם הבוכנה נגיעה בכף יד ימין.
- תפוס את העכבר משותקת בתוקף על ידי העור מאחורי הראש בעזרת יד שמאל במקום על אור סיבים אופטיים כדי להאיר מבנים אנטומיים רלוונטי שיכול לשמש כמדריך.
- הכנס את מחט 2 מ"מ עמוק, בניצב לפני השטח בגולגולת, במיקום כ 0.25 מ"מ לרוחב תפר sagittal ו - 0.50-0.75 מ"מ מקורי אל תפר כלילית בילוד (איור 1A). ואז, לדחוף את הבוכנה באמצעות כף היד של יד ימין מאוד לאט ובזהירות. צג עבור כלי מקרע או נפיחות בפנים.
- הסר את המחט 15 שניות לאחר הפסקת תנועת הבוכנה כדי למנוע backflow.
- כדי לשחזר, לשמור על עכברים למשך 5-10 דקות במיכל חימם עד התנועה ואת ההיענות הכללית היא כנו.
2. הזרקה תוך ורידי דרך הווריד הזמני / פנים
- הפתרון להיות מוזרק צריך להיות מוכן להשלים עם צבע מאכל ירוק מסונן על דילול 1:100 והזריקו בתנאים סטריליים.
- צרף פלסטיק קטנה luer לסוף מזרק 100 μL המילטון זכוכית. כדי luer, לצרף 33 0.25 אינטש מד מחט המזרק. להבטיח כי כל החלקים מחוברים היטב.
- טען את המזרק עם נפח להיות מוזרק, להבטיח כי יש אוויר בתוך המזרק כמו הזרקת אוויר לתוך כלי קטלני. לעתים קרובות מועיל pipet נפח להיות מוזרק אל פיסת parafilm. זה מאפשר ראיה ברורה של ספיגת הפתרון לתוך המזרק.
- Transilluminator מראה Wee משמש לחזות בקלות את הווריד הזמני שטחית, או וריד הפנים, ב הילוד (איור 2 א). לפני ההזרקה, כדי להבטיח את הילוד transilluminator באמצעות פלסטר. גזה צריך להיות ממוקם בין הילוד לבין קלטת כדי למנוע את הקלטת מפגיעה העור של החיה. Secure את בעל החיים transilluminator בצד שלה, להבטיח כי הקלטת אינה מונעת הנשימה. הצוואר של רך נולד יש פנתה בעדינות כך וריד הפנים גלוי בקלות את האף צריך להיות מודבק על מנת לייצב את הראש.
- בעזרת זכוכית מגדלת סרט 2.25X כדי לאפשר ראיה קל, לאט לאט להכניס את המחט לווריד. וריד היא שטחית מאוד כך המחט צריכה להישאר גלוי מתחת לעור.
- לאט לאט להחדיר את עוצמת הקול של פתרון לתוך הווריד. צבע ירוק מאפשר ראיה קל של הזריקה.
- המתן 15 שניות לפני הסרת מחט כפי שקיים פער בין באופן מלא מדכא על הבוכנה של המזרק וגירוש הפתרון הנותרים עקב נשא מחט צר ביותר.
- לאחר הסרת המחט, שימוש גזה להפעיל לחץ על הזריקה עד שהדימום נפסק.
- צג הילוד סימנים של מצוקה. לאחר הזרקת ראויה, אין מצוקה גלויה יש לשים לב. רך נולד יש לתת כ 5 דקות כדי להתאושש לפני שהוא חזר הכלוב.
- פלאש יחידת מחט / מזרק עם PBS בין זריקות כמו דם המחט מהר לסתום אותו בשל נשא קטן.
3. נציג התוצאות:
ICV הזרקה: המוח ניתן לקצור בכל זריקה שלאחר בנקודות שונות בזמן דמיינו להפגין טכניקה זריקה מוצלחת. אם הצבע לא מתווסף פתרון הזריקה, זה יהיה קשה לבדוק את הדיוק של בjection. הזרקה נכונה של אחד החדרים תאפשר הפצה של כחול trypan בצד מוזרק של המוח כ 10-15 דקות לאחר הזרקה (איור 1B). התפלגות אחידה של trypan כחול בשתי אונות המוח על ימין ועל שמאל נורות הריח יהיה גלוי כ -60 דקות הזרקת פוסט (תרשים 1C). זאת בשל קישוריות של החדרים מוחין אשר יאפשרו את הפצתו של צבע כחול על החדר הסמוך. זריקות מדויקות ניתן דמיינו ידי פיזור של צבע כחול מקורי בתעלת השדרה המרכזית כ בתוך 12 שעות לאחר ההזרקה (1D איור). זריקות שגוי ניתן להבחין בחוסר צבע כחול אונות המוח. במקרה זה, את העומק של המחט לא היתה מספקת את הפתרון הזרקת הפיצה כנראה מתחת לעור. אפשרות חלופית היא כי המחט חדרה עמוק מדי במוח, ובכך עובר מעבר החדר והפתרון הוא רוקן מתחת החדרים מוחין.
הזרקה IV: מדויק ויעיל הזרקה לווריד הזמני / פנים ניתן דמיינו מיד לאחר ההזרקה. כמו הפתרון מוזרק, לצבוע בירוק מאפשר הדמיה של הפתרון הנכנסים זורם דרך וריד הפנים (איור 2 א). בנוסף, שינוי צבע העור של העכבר יקויימו הזריקה הבאה. צבע ורוד נורמלי של הילוד מומר ירוק, בשל נוכחותם של צבע מאכל ירוק בפתרון הזרקה (2B איור). היקף לשנות את צבע ירוק שנצפתה הילוד תלוי ריכוז של צבע המשמשים. להדמיה פשוטה של הזרקת בתקופה בפועל, דילול 01:50 מומלץ. עם זאת, צבע העור משתנה באופן דרמטי לעתים קרובות תוצאות הגור מדחייה של האם ולכן, הסרת צבע או ריכוז הקטינה באופן משמעותי יש לשקול במהלך הפרוצדורות. הזרקה מדויקת תגרום הצטברות של צבע ירוק מתחת לעור במקום של הזריקה. זריקה הושלמה, אשר מתרחשת כאשר הפתיחה של המחט אינו מוכנס היטב בתוך הווריד, נתפסת כאשר פתרון כמה זורם בווריד וחלק מצטבר מתחת לעור. אם זאת הוא ציין, המחט צריך להיות מוכנס לתוך כלי נוסף.
באיור 1. הפגנה מוצלחת של זריקות ICV ב PDN2 עכברים. סכמטי) של אתרי הזרקה מנוצל ICV זריקות לתוך החדרים. B) מן המוח ICV מוזרק גור עם trypan כחול PBS על החדר השמאלי, תמונה שצולמה 15 דקות הזרקת הודעה. C ) מן המוח ICV מוזרק גור עם trypan כחול PBS על החדר השמאלי, תמונה שצולמה 60 דקות הזרקת הודעה. D) מקורי תעלת השדרה המרכזית מוצגת ICV מוזרק הגור עם trypan כחול PBS על החדר השמאלי, תמונה שצולמה 12 שעות שלאחר ההזרקה.
איור 2. הפגנה מוצלחת של זריקות הרביעי PDN2 עכברים. סכמטי) של וריד הפנים מנוצל IV זריקות. B) IV מוזרק גור עם צבע ירוק PBS לעומת להמלטה בלתי מוזרק, צולם הזרקת לפרסם באופן מיידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים באמצעות מודלים העכבר של המחלה לעתים קרובות מחייב את הממשל של תרופות או חומרים אחרים בילודים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את צעד אחר צעד הליכים מעורבים שני סוגי אסטרטגיות הזרקת שיכולים לשמש למטרה CNS: 1) הזרקה ישירה לתוך מערכת העצבים המרכזית ניצול (ICV) הזרקה intracerebroventricular, או 2) הזרקה IV מיקוד / הזמני הפנים וריד. העיתוי של זריקות אלה היא בעלת חשיבות רבה. מאז זריקות ICV הם חופשי, הגולגולת חייב להיות נזיל יחסית. זה סוג של זריקה אפשרית רק באמצעות בשבוע הראשון של החיים, ואז הוא הופך יותר ויותר מאתגר יותר מזיק לבעלי החיים כמו גיל החיות. עם זאת, היתרון העיקרי הוא כי משלוח ישיר של מערכת העצבים המרכזית מושגת, למעשה לעקוף את מחסום הדם במוח. לכן, אם חוקר מפתחת הרפוי CNS, אפשר לנתח תרכובות שאינן אופטימיזציה מלאה עבור סמים כמו מאפיינים כגון חדירות מחסום דם מוח, לעומת זאת, פעילות במתחם ניתן למדוד מחלות רלוונטיות רקמות. השימוש וריד הזמני במהלך הימים הראשונים של החיים הוכיחה יקר כמו זה היא טכניקה לא פולשנית יחסית לממשל הרביעי הכללי. בשלב זה התפתחותית, לא ורידים נוספים נגישים בקלות, כמו וריד הזנב אשר הופך נגיש יותר במהלך השבוע השני של החיים 5. שני טכניקות ההזרקה בטוחים ניתן לבצע חופשי, עם עכברים מחלים זמן קצר לאחר ההזרקה, ללא תופעות לוואי מזיקות. טכניקות שניהם מתאימים הזרקה מהירה של קבוצה של בעלי חיים בתקופה קצרה של זמן. הם דורשים ראיה נכונה של השטח המיועד להבטיח זריקה מוצלחת. זה מסופק על ידי transilluminator ואת סרט מגדלת IV הזרקה (טבלה 1) ואור סיבים אופטיים הזרקת ICV.
אחד היתרונות של הזרקה IV היא כי נפח גדול יותר (100 Ll ∞) ניתן להזריק עם שיעור הצלחה של 90% ~ 6. בעיות נפוצות נתקל תוך לימוד הטכניקה IV כוללים מוזרים מחט תת עורית וכתוצאה מכך זריקות ו / או זריקות שלם. בעיות אלה ניתן יהיה להתמודד ידי הבטחת שיפוע של המחט הוא מושחל ביסודיות באמצעות הכלי. המחט צריך להיות מוכנס לתוך כלי השיט רחוק מספיק כי שיפוע של המחט מוקפת לחלוטין על ידי הכלי. בנוסף, הכלי היא שטחית ביותר, ולכן ההזרקה חייבת להבטיח כי המחט היא כלי ולא מתחתיו. כדי לבדוק אם המחט היא הכלי, לאחר מיקום המחט יש להעביר בעדינות מצד לצד. אם המחט חדרה את כלי השיט, כלי השיט ינועו יחד עם המחט. אם הכלי לא זז, המחט לא מוכנסת כראוי. ביצוע בדיקה זו לפני הזריקה יהיה להגדיל את מספר זריקות מוצלחות. מסירה של ילודים AAV9 וקטורים נוצל לאחרונה בהצלחה transduce אחוז גבוה של נוירונים המנוע באמצעות רקומביננטי וקטורים AAV בעכברים SMA 7,8.
השיקול החשוב ביותר בעת ההזרקה ICV כרוך אורך של קצה המחט. טיפ חייב להיות זמן מספיק כך שהוא יכול לחדור לפחות 2 מ"מ בגולגולת. אם קצה אינו ארוך מספיק, המחט לא יוכלו ביעילות להיכנס החדרים. לחילופין, אם קצה ארוך מדי, זה מעכב את ספיגת של הפתרון להיות מוזרק, וגם יוצר קצה שביר שקשה מדריך נכונה דרך הגולגולת. הזווית של המחט חשוב לוודא חדירה מדויקת לתוך החדר על ידי אחיזתו בניצב הגולגולת עם קצה כלפי תפר sagittal. זריקות ICV כבר נוצלו במחקרים רבים להציג תרכובות, סמים, RNAs טיפולית, DNAs פלסמיד, ו וקטורים ויראליים לתוך מערכת העצבים המרכזית של מודלים בעכברים חולים 4,9-17. עם זאת, הגורם המגביל הזרקת ICV הוא היכולת קטן של החדר המוח בעכברים יילודים כי לא יכול לאפשר חדירה של אמצעי אחסון הרצוי של סוכני טיפולית. לכן, היכולת להגיע לרמות ביטוי טיפולית שימוש במינון נמוך וקטור בתקופה קצרה של זמן חשוב במיוחד כאשר נפח המשלוח מוגבל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ג'ון Marston עבור המומחה גידול בעלי חיים, ד"ר מרקו א Passini לקבלת סיוע טכני בשלבים המוקדמים של הפרויקט הזה. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי כדי CLL (R01NS41584; R01HD054413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Green Food Dye | McCormick & Co. | n/a | Must be filtered |
| Hamilton Glass Syringe (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| LuerMxF Thread Style White Nylon | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| Fine gauge Hypodermic Needles | Popper & Sons, Inc. | 7111 | Size: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM) |
| Wee Sight Transilluminator | Respironics | 1017920 | |
| 2.25X Headband Magnifier | MagEyes | Model No. 5 | Select magnification to fit individual preferences |
References
- Blanchette, M., Fortin, D.
- Foust, K. D., Kaspar, B. K. Over the barrier and through the blood: to CNS delivery we go. Cell Cycle. 24, 4017-4018 (2009).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain. Nature. 374, 367-370 (1995).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J. Virol. 24, 12382-12392 (2001).
- Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 50-54 (2007).
- Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Lab. Anim. Sci. 49, 328-330 (1999).
- Foust, K. D. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat. Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
- Foust, K. D. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene delivery to the mouse brain with adeno-associated virus. Methods Mol. Biol. 246, 225-236 (2004).
- Coady, T. H., Lorson, C. L. Trans-splicing-mediated improvement in a severe mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 30, 126-130 (2010).
- Baughan, T. D., Dickson, A., Osman, E. Y., Lorson, C. L. Delivery of bifunctional RNAs that target an intronic repressor and increase SMN levels in an animal model of spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 18, 1600-1611 (2009).
- Coady, T. H., Baughan, T. D., Shababi, M., Passini, M. A., Lorson, C. L. Development of a single vector system that enhances trans-splicing of SMN2 transcripts. PLoS One. 3, e3468-e3468 (2008).
- Dickson, A., Osman, E., Lorson, C. A. Negatively-Acting Bifunctional RNA Increases Survival Motor Neuron in vitro and in vivo. Hum. Gene. Ther. 19, 1307-1315 Forthcoming.
- Mattis, V. B., Ebert, A. D., Fosso, M. Y., Chang, C. W., Lorson, C. L. Delivery of a read-through inducing compound, TC007, lessens the severity of a spinal muscular atrophy animal model. Hum. Mol. Genet. 18, 3906-3913 (2009).
- Williams, J. H. Oligonucleotide-mediated survival of motor neuron protein expression in CNS improves phenotype in a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Neurosci. 29, 7633-7638 (2009).
- Passini, M. A. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. J. Clin. Invest. 120, 1253-1264 (2010).
- Shababi, M., Glascock, J., Lorson, C. L. Combination of SMN Trans-Splicing and a Neurotrophic Factor Increases the Life Span and Body Mass in a Severe Model of Spinal Muscular Atrophy. Hum. Gene. Ther. 22, 1-10 (2010).
