Summary
我々は、挙筋オーリス筋（LAL）若い成体マウスの筋肉にムスカリン性シグナル伝達の阻害剤の反復投与のためとwholemountsにおける神経筋接合部のその後の免疫染色（NMJs）するための手順を説明します。 LAL筋肉は明らかにするためのユニークな利点があります
Abstract
このような腓腹筋と前脛骨筋などのげっ歯類の後肢の筋肉が、、頻繁に哺乳類NMJsの形成と維持に不可欠なシグナルの in vivo薬理試験で使用されます。しかし、皮下または筋肉内投与後にこれらの筋肉への薬物の浸透は、しばしば不完全または不均一であり、多くのNMJsは影響を受けませんができます。このようなミニポンプなどの機器との全身投与は、時空間の効果を向上させることができるが、このアプローチの侵襲的な性質は、交絡炎症応答および/または直接筋肉の損傷を引き起こす可能性があります。それは時間のかかるシリアルセクショニングと豊富な免疫染色を必要とするためまた、後肢の筋肉におけるNMJsの完全な分析は困難です。
マウスLALは首の背部に表面的にある筋肉の薄い、平らなシートです。それは、関数が耳介を移動することが速筋筋肉です。それは頭蓋骨の正中線に由来し、それぞれの耳介の軟骨部に横方向に拡張する吻側および尾側部分が含まれています。筋肉は、それが終了する茎乳突孔を次のように尾側に投影する顔面神経の枝によって供給される。我々と他の人がNMJsと筋肉での薬物の in vivo効果で短期と長期の両方の調査のための利点を提供する便利な準備であることがLAL発見した。最初に、その表面的な場所は軽い麻酔下での薬剤の複数のローカルアプリケーションを容易にします。第二に、その薄さ（筋線維の2-3層）は、筋肉内のほぼすべてのNMJsの可視化と分析を可能にします。第三に、その神経支配のパターンと一緒に無傷の神経でそれを解剖しやすさは、 試験管 9,5 の補足的な電気生理学的解析を可能にします。おそらく最後の、そして最も重要な、小さなappliedボリューム（〜50μlのは）簡単に、全体の筋肉の表面を覆って薬剤へのすべてのNMJsの制服と長期の暴露を提供し、体系的なアプローチ1,8が不要になります。
Protocol
1。ムスカリン性アセチルコリン受容体（mAChR）拮抗薬の皮下投与
- 1.5mlの反応チューブに滅菌生理食塩水で薬物を溶解することにより無菌条件下でmAChR拮抗薬、（参照、表）の適切な投与量を準備します。以下の拮抗薬を使用した：アトロピン、Methoctramine、4 - DAMP、AFDX - 116、AFDX - 384、MT 7。
- a1ccインスリン注射器に溶液の50μlのを描き、それぞれのマウスに別々のシリンジを使用してください。また、唯一の対照群の各マウスの生理食塩水を含む注射器を準備。氷の上で注射器に注入する準備が整うまで保管してください。
- ケタミン - キシラジンカクテルを持つマウスを麻酔する（120 mg / kgのケタミン、8 mg / kgをキシラジン）つま先のピンチに応答がないことを観察することによって適切な麻酔深度を確認してください。
- 適切な鎮静した後、首の尾部領域に頭の吻側領域をカバーする毛を剃る、70％エタノールで離れて残りの髪を拭いてください。
- 場所の実体顕微鏡下でマウス、および注射器の針（ 図1A、B）を軽く引き上げながら、LAL筋肉に針を平行に挿入する。これは、針が結合組織の上に横たわって挿入されると直接LAL筋肉自体を損傷しないようにします。先端がLAL筋肉の尾側面を覆うように針を挿入します。
- 非常にゆっくりとシリンジを引き出しながら、右LAL筋肉上のソリューションを注入し始める、総噴射時間は約1分にする必要があります。適切に注入した場合、解決策は、少なくとも1時間にとどまるが覆っている皮膚に、直径約1 cmである"ドーム"を形成すべきである。一様に注入されたソリューションは、右のLAL筋肉の全体の吻側および尾側の地域をカバーします。
- 1〜7日間12時間ごとに手順を繰り返します。他のstudies1では、最大21日間の増殖因子を12時間おきに注入するために同じプロトコルを使用していました。異常応答は、最大21日までの日を2倍の麻酔を投与したマウスから観察されなかった。
2。 LAL筋肉の解剖
- ペントバルビタールナトリウムの過剰投与（390 mg / kg体重）をマウスを安楽死させる。死は、開胸が行われた後、ハートビートの欠如を評価することによって保証されます。
- それぞれの足の1ピンと鼻から1ピンで、解剖皿の中で背側にマウスを突き止める。
- 左の肩甲骨周辺の領域への耳にちょうど近位領域から左LALに沿ってカットする小さな春のはさみを使用して、唯一の皮膚を介して最初の切開を加えます。
- 慎重にこの地域で皮膚を取り除くが、これは右のLAL筋肉のための付属のポイントの一つであるとして、右耳に近すぎるカットは避けてください。
- 右と左のLAL筋肉が満たしてヘッドの表面的な面で、正中線に沿って脂質の中央に位置脂肪組織のストリップを見つけます。小さ な春のはさみを使用して、肩（ 図1C）に達するまで左LAL筋の近位端から脂肪組織（左耳に向かって）の右側に1センチメートルカット。
- 一度切開は筋肉の腹側を露出させる小さな鉗子で背面剥離、右LAL筋肉が行われます。慎重にピンセット（ 図1C）で右LAL筋肉を引き上げながら、結合組織や筋膜をトリミング。
- 耳の付け根で右LALの尾方端の周りにカット。に引き渡した右LAL（図1C）を維持、右耳の吻側端に向かって移動し、切断を続行。。 LAL自体を損傷する危険性よりも、このステップでより多くの組織を含める方が良いです。筋肉は、筋肉の上にピペット1X PBSを乾燥し始めた場合。
- 場所は、最大1 × PBS、背側を含む30ミリメートル文化Sylgard皿で右LAL解剖。小さな虫ピンで筋肉の四隅を突き止める。
- 右LAL筋の背側と腹側の表面から小さな鉗子と春のはさみ、クリーンな結合組織を使用する。腹側表面をきれいにするために筋肉を裏返しにして、再度ピン。 2月3日の筋肉は、同じ30ミリメートル皿に置かれるかもしれない。
3。 LAL NMJsのトリプル免疫染色：1日目
- 免疫染色を開始する前に、すべての必要な試薬を準備する。 1X PBS、2％ウシ血清アルブミンBSA）/ PBS、2％の0.1MグリシンBSA / PBS、2％BSA / PBS、および1X PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で0.2％トリトンX100が必要になります。 -20℃の冷凍庫内プレクールメタノール。
- このプロセスの間に皿の背側にまで固定されたLAL筋肉を残す。 1X PBS溶液を捨て、筋肉をカバーするのに十分な4％（PFA）を追加します。シェーカー上に置いて料理は20分間スピード2または3に設定。特に断りのない限り、料理は、以下のステップのためにシェーカーに配置する必要があります。
- 4％PFAを破棄し、1X PBSで3回、10'それぞれで筋肉を洗う。
- 最後の1X PBSの洗浄を破棄し、30'のために2％BSA / PBS溶液に0.1Mグリシンを追加。
- 0.1Mグリシン溶液を捨てるdは、1 × PBSで15'の1:200の濃度でローダミン共役α-ブンガロトキシンを含む追加。
- α-ブンガロトキシンの液を捨て、それぞれ3回、1 × PBS中で10'の筋肉を洗う。
- あらかじめ冷却メタノールを添加することにより組織を透過し、正確に5分間-20℃の冷凍庫に皿を置く、ない必要に応じて揺れていない。
- メタノールを取り外し、10'1X PBSでそれぞれ3回洗浄します。と最後の洗浄およびブロックの組織を捨てる0.2％トリトンX - 100を2％BSA / PBSで1時間。洗浄及びブロッキングのステップは室温で実施されています。
- 4で、揺れ、一晩筋肉をインキュベートしますブロッキング溶液（参照、表）で希釈した一次抗体のカクテルでC。
4。 LAL NMJsのトリプル免疫染色：2日目
- 室温で1 × PBSで3回、10'それぞれの筋肉を洗う。
- 室温で1時間（参照、表）のためにブロッキング溶液に二次抗体のカクテルを追加。アレクサ - フルーア647蛍光の光退色を防ぐために、筋肉はこのステップ以降からの光から保護する必要があります。
- 1X PBSで3回、10'それぞれの筋肉を洗う。
- 1X PBSの残りの結合組織をきれい、ガラスカバースリップとマウントメディアを使用して、スライド背側LAL筋肉とマウントの外側の境界線をカット。代わりにカバースリップを確保するために明確なマニキュアを使用してください。
- 分析の準備が整うまで-20℃で光とストアからスライドを保護する。
5。 LAL NMJsの共焦点イメージング
- 高解像度の共焦点画像は、ライカTCS 4D共焦点顕微鏡ライカのプランアポ63Xの油浸対物（1.4NA）で得られる。
- フルオレセインおよびAlexa 647の信号が同時にそれぞれ、レーザライン488nmの（アルゴン、488 nmの、20 MW）と633 nmの（HeNeレーザ、633nmの、10 mWの）でスキャンした。順次、ローダミンの信号は、レーザーライン561 nmの（DPSS、561、20 MW）でスキャンされます。光学切片を0.3μmの間隔で収集し、z平面上の画像の数が60から80まで変化させた。ピンホールは、エアリー1（107.97 UM）に調整されます。画像フォーマット1024 × 1024（X、Y）、234.32μmのX 234.32μm及び229.05 nmのピクセルサイズ× 229.05 nmの画像サイズで400Hzの速度の結果で1のズーム倍率、と。
- ライカTCS - NT取得ソフトウェアは、最大強度の予測にZシリーズの画像を再構成するために使用されます。
- マルチパネルの画像はAdobe Photoshopを使用して明るさとコントラストに調整されます。
- 典型的なLAL筋肉のために、人は顔の NMJs 途中で約75から100を分析することができるはずです。シナプスの安定性は、事前に、周術期およびシナプス後要素の空間的配置（すなわち、神経、シュワン細胞や筋肉）などの機能、及びシナプス面積の測定（すなわち、シナプスの大きさ）によって決定されます。
代表的な結果：
、正確にニコチンAChRsのシナプス後のクラスター（ 図2、レッド）に並列した単一の筋線維で、成体哺乳類NMJで、単一のモータの軸索は、神経終末の高度に差別化喬木（グリーン図2）を形成細かい枝を詳しく説明。 Perisynaptically、ターミナルシュワン細胞が密接にシナプス前神経末端のすべての支店（;ブルー図2）をカバー。この三者の組織の構造的および機能的完全性は深刻なサブタイプ固有のmAChR阻害剤の毎日のアプリケーションによって摂動されています。 （ 図3）ここで紹介する例では、4 - DAMP、M1、M3、M4とM5 mAChRサブタイプに高い親和性を持つmAChR拮抗薬は、筋肉の表面（ 図3B、全体に多数のNMJsから神経端末の選択的除去を呼び起こすC）。プロセスの拡張子を除いた明るいS100のラベリング（ 図3B"、3C"）によって証明されるように加えて、ターミナルシュワン細胞は8異常に静止です。 Postsynaptically、筋線維は正常であり、nAChRsの失われた（ 図3B"、3C'）はありません。
図1。LAL筋肉の解剖学的位置と組織。吻側（rLAL）、尾側（cLAL）、およびLAL神経（LALn）と対応するエンドプレートのバンドの位置は（、挿入図）が示されている。 LAL筋肉に関しての針の位置と方向は、注射の手順（B）のために示されています。切開ポイントは解剖の手続き（C）として使用されています。
図2。NMJの三者構成。マウスNMJの高倍率焦点ビュー。単一の軸索は、しっかりとターミナルシュワン細胞とそのプロセス（ターミナルシュワン細胞体へ"、アスタリスクポイント）の対象となる微細な端末の枝を（）、詳しく説明する。 Postsynaptically筋線維では、ニコチンAChRsのクラスタは、正確に神経端末の枝に並列したさnalsとターミナルシュワン細胞。
図3。LAL筋は4 - DAMP、mAChR拮抗薬による治療を受けた。車両または4 - DAMPで治療LAL筋肉の低と高倍率共焦点ビュー。溶媒投与筋肉（とは対照的に、A - '''), 4 - DAMP処理筋肉の欠如の神経終末の数々NMJs（B - B '''、C - C ''').図2Bの箱入りの領域は、図2Cにズームされています。
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Discussion
ここで紹介する方法は、哺乳類NMJsの安定と維持におけるシグナル伝達サブタイプ固有のmAChRの以前に認識されていない役割の調査を可能にします。また、このメソッドは、神経栄養因子および薬理学的作用物質の効果をテストするために有用であろう。例えば、私たちの研究室では、毛様体神経栄養因子（CNTF）は、成体マウスのほぼすべてのLAL神経末端から発芽誘発されることがわかった1 。この結果は、カリフォルニア州で発芽中程度の報告CNTF処理後肢の筋肉、の以前の研究とは対照的。臀筋と外側腓腹筋接合3の9％の13から33パーセント。我々は、不一致が後肢の筋肉よりもLALのCNTFに神経末端のより均一と長期暴露によるものと考えています。確かに、我々は外側腓腹筋と広範なほぼすべてのLAL NMJsから発芽を誘発同じプロトコルを使用して、前脛骨筋にCNTF適用されたとき、我々は弱い優先的に注射部位の近くに位置していたNMJsのわずかな数から発芽を観察した。どう やら、CNTFに後肢のNMJsの曝露は、また以前の研究で述べたように、限られており、不均一されていた2 。一方、CNTFは皮下結合組織とLAL筋膜の間に注入し、しかし、CNTF後肢の筋肉に皮下注射ではない、血管再吸収する前に少なくとも1時間は持続ローカル、皮下腫脹を結成。またCNFTまたはmAChR拮抗剤の注入の頻度は毎日4回にまで増加した場合でも、我々はCNTFとmAChR拮抗剤の、特に添加剤の効果を観察していないことは注目に値する。さらに、注入の手順が適切に実行された場合、それは直接的な筋肉の損傷が起こるとは考えにくい。一した場合は、注入の手順の間に損傷筋肉が、神経末端にまたはノードにおける軸索発芽、および/ または筋線維の変性は、1,8を観察することができた。要約では、LAL筋肉が比較的簡単かつ迅速な手続きで筋肉内のすべてのNMJsのユニフォーム、長時間露出を可能にする、独特な準備です。
LAL筋肉の狭い尾部は広い吻側部（厚さ2から3筋線維）より（3-5筋線維厚い）厚いです。したがって、深く尾LALに配置された筋線維に関連付けられているNMJsは、しばしばどちらwholemount免疫染色で標識したり、のみ、その小さいサイズとnAChRsに対して高い親和性に起因する抗体をより深く浸透α-ブンガロトキシン、によってラベル付けされていません。これらNMJsは、失われた神経末端または適用薬物の特定の影響に起因するシュワン細胞を持つものとして誤って解釈することができます。それは、これらの接合は、唯一の尾LALで観察されているかどうか注意することが重要である、とNMJsまたは筋肉の繊維が表面的または深くに配置されているかどうか：表面的に配置さ筋繊維は通常深くに位置する繊維よりもはるかに高いバックグラウンドの免疫に関連付けられている。別の方法として、wholemount分析からLALの尾ストリップに深く位置付けNMJsを省略することができます。
LAL神経の完全な切除は比較的容易であると私たちは脱神経筋にmAChRの阻害の効果を研究するために許可されていますが、LAL神経の大きさとアクセシビリティは、調査可能な外科的アプローチの種類を制限する。例えば、部分的にLAL筋肉の部分的脱神経を誘導するために、LAL神経を損傷することは技術的に非常に困難なようである。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、筋ジストロフィー協会、NIH（NS062320）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
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