Summary
Biz aksi takdirde standart laboratuvar ters transkripsiyon reaksiyonları mRNA tek hücreli miktarda cDNA verimi artırmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Yenilik, titreme, vorteks veya öğütme daha etkili mikrolitrelik ölçekler sıvıları karıştırmak için, akustik microstreaming fenomeni kullanan bir micromixer, kullanımı bulunur.
Abstract
Gen ekspresyonu hücre davranışı ile ilişkilendirerek ideal tek hücre düzeyinde yapılır. Ancak, tek bir hücrenin (1-5, 1-50pg toplam RNA ya da% 0.01-2.5pg mRNA, hücre başına 1) mevcut labil mRNA transkripsiyonu tersine çevirmek için önce küçük bir miktar daha çok düşürür, çünkü bu kolayca elde değil . istikrarlı bir cDNA kopyası haline. Örneğin, standart laboratuar reaktifleri ve donanım kullanarak, genlerin sadece az sayıda hücre başına 2 nitel değerlendirilir olabilir. MRNA tek hücreli miktarda oluşan standart laboratuvar ters transkriptaz (RT) reaksiyonlar (mikrolitrelik hacimleri yani standart reaktifler) verimliliği artırmak için bir şekilde düşürür önce mRNA cDNA dönüştürülebilir, böylece daha hızlı reaktifler karıştırmak olacaktır. Ancak mikrolitrelik ölçekler sıvı akışı laminer olduğunu, çünkü bu önemsiz değildir, yani mevcut karıştırma yöntemleri (sallayarak, vorteks ve öğütme yani), etkin bir şekilde reaktifleri karıştırmak için yeterli kaotik hareket üretemez. Bu sorunu çözmek için, mikro ölçekli karıştırma teknikleri 3,4 kullanılır. Mikroakışkan tabanlı karıştırma teknolojileri başarıyla RT reaksiyon verimi 5-8 artış geliştirilmiştir. Ancak, Mikroakiskan teknolojileri, nispeten pahalı ve henüz yaygın değil özel bir donanım gerektirir. Daha ucuz, daha rahat bir çözüm arzu edilir. Bu çalışmanın ana amacı, mRNA tek hücreli miktarlarda oluşan standart laboratuvar RT reaksiyonlar bir romanı "micromixing" tekniği uygulaması cDNA verimi önemli ölçüde artırır nasıl göstermektir. Biz cDNA verim sağlar yaklaşık 10-100-katlama, artış bulabilirsiniz: (1) daha fazla sayıda hücre başına analiz edilmesi gereken genler, gen ekspresyonu (2) daha düşük bolluk genlerin kantitatif analiz ve (3) daha iyi algılama tek hücre. Micromixing akustik, 9-12 küçük bir engel etrafında yayılan ses dalgalarını engel yakın bir ortalama akışı oluşturmak bir fenomen microstreaming dayanmaktadır. Biz kilit bir sadeleştirme ile akustik bir microstreaming tabanlı cihaz ("micromixer"); akustik microstreaming sistemi, küçük bir eğrilik 13 yarıçapı ile bir sıvı-hava arayüzü sağlayarak ses frekansları elde edilebilir . Bir tüp bir çözüm mikrolitrelik hacmi menisküs uygun küçük bir eğrilik yarıçapı sağlar. Ses frekanslarının kullanımı, donanım ucuz ve 13 çok yönlü olması anlamına gelir ve standart laboratuvar sonicators olabileceği gibi, nükleik asitler ve diğer biyokimyasal reaktifler zarar görmezler.
Protocol
1. RT Reaksiyon Micromixing
- Micromixing RT tepki gerçekleştirmeden önce, RT tepki istenilen sıcaklığa micromixer dengelenmesi.
- Micromixer 37 içine yerleştirin ° C (veya RT tedarikçi tarafından tavsiye edilen sıcaklık) inkübatör RT reaksiyonun başlangıcı için en az 1 saat önce için.
- RT karışımı ters transkriptaz tedarikçisi göre ayarlayın (örneğin Promega, Qiagen gelen Omniscript MMTV-RT) talimatları yerine ng-mg giriş toplam RNA (örneğin 0.1-1pg/μl), tek hücreli miktarda hariç tedarikçiler tarafından tavsiye edilen miktarda.
- Biz standart steril, nükleaz 200μL ince duvarlı PCR tüpleri kullanırlar.
- Karıştırma için hazır olan en kısa sürede güvenli bir şekilde micromixer içine pozisyon RT tüpler. Micromixer RT reaksiyon süresi 37 ° C inkübatör içinde kalmalıdır.
- Uygun frekans ve micromixing genlik seçin. Bu örnekte, 150Hz kullanın.
- Micromixer açın ve RT tepki (60 dakika) süresi boyunca bekletin.
- Micromixer kapatın ve RT reaksiyon tamamlandıktan sonra RT tüpleri almak.
- RT tüpleri, buz üzerinde yerleştirin ve kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR veya gerçek-zamanlı PCR) gibi daha fazla uygulamaları ile normal olarak devam edin.
2. Temsilcisi Sonuçlar:
RT reaksiyonlar bağlamında micromixing yararı cDNA verimi diğer karıştırma yöntemleri (örneğin, sallayarak karıştırın veya öğütme) kullanıldığında göreceli bir artış. Bu cDNA kullanarak kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR veya gerçek-zamanlı PCR) sonraki analizi üzerine, örneğin, görülebilmektedir. Şekil 2A hemen önce RT inkübasyon (siyah, "öğütme" RT reaksiyon öğütme ile karşılaştırıldığında, ilk 5 dakika için micromixing etkileri (mavi, "micromixed5") ya da tüm 60 dakika (kırmızı, "micromixed60") göstermektedir .) Bu durumda önceki RT reaksiyon hacmi 25μL ve total RNA 2.5pg içeriyordu. cDNA temsil Nurr-1 mRNA algılamak için tasarlanmış primerler kullanılarak qPCR izleri yukarıda gösterildiği anlamına gelir ± 3 Bu aynı deneyi tekrarlar% 50 maksimum floresans ulaşmak için döngüleri sayısı SEM'ler aşağıda çizilir. Yıldız işareti (Tukey çoklu karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA) istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermektedir. Önceki RT reaksiyon tüm 60 dakika boyunca micromixing öğütme üzerinde önemli bir gelişme ise önceki RT reaksiyon ilk 5 dakika micromixing öğütme üzerinde anlamlı olmayan iyileşme üretilen, büyüklüğü yaklaşık 15 qPCR eşdeğer döngüleri, ortalama.
Micromixing yararı da elde edilen sonraki qPCR ürünlerin erime eğrisi analizinin görülebilir. Sadece tutarsız qPCR üretilen ilk 5 dakika veya öğütme için micromixing ise, önceki RT reaksiyon tüm 60 dakika boyunca micromixing Şekil 2B gösterilen deney, tutarlı bir yinelenen örnekleri qPCR sinyal (Şekil 2BA, 2 kırmızı izleri) sonuçlandı izleri (Şekil 2BA, 2 mavi izleri ve 2 siyah izleri, sırasıyla). Gri izleri qPCR reaksiyon kaldı cDNA hangi negatif kontroller ("negatif"). Bu deneyde qPCR ürünleri belliydi sıcaklığı (yani erime eğrisi analizi) Ramping denatüre olduğunu ne zaman uygun PCR ürünleri (yani, mRNA çok daha yüksek konsantrasyonlarda ters qPCR transkripsiyonu ve amplifiye edildi, elde edilen aynıydı bir Amplikon gösterilmemiştir) 60 dakika (Şekil 2BB, 2 kırmızı izleri) micromixed olmuştu sadece RT reaksiyonlar sunuldu. Tüm diğerleri (yani micromixed5, öğütme ve negatif kontroller), alternatif Amplikon ürünler (örneğin, astar dimerleri) oluşturulur.
Şekil 1 standart laboratuvar RT reaksiyonlara micromixing uygulamak için protokol Akış diyagramı. Referanslar 13,14 fiziksel prensibi yer micromixer ve nasıl bir in-house micromixer inşa etmek için daha ayrıntılı açıklamalar verilmiştir
Şekil 2 RT aksi standart laboratuvar RT reaksiyonlarda mRNA tek hücreli miktarlarda oluşan reaksiyonlar önceki uygulanan micromixing faydaları gösteren Temsilcisi qPCR veri Nurr-1 genini kodlayan cDNA temsil eden mRNA tespit qPCR izleri Bir Örnek. Önceki RT reaksiyonlar 25μL hacmi toplam RNA 2.5pg yer alan ve 37 ° C'de 60 dakika için bir kuluçka yapıldı. RT reaksiyonlar R öğütme tarafından karıştırıldıT RT reaksiyon (mavi izleri "micromixed5") ilk 5 dakika boyunca (kırmızı izleri "micromixed60" micromixed veya RT reaksiyon tüm 60 dakika boyunca micromixed inkübasyon (siyah izleri "öğütme") önce karışmaktadır .) Ortalamalar ±% 50 maksimum floresans ulaşmak için gerekli qPCR döngülerinin sayısı SEM'ler aşağıda çizilir n = 3 bu deneyi tekrarlar. Asterisk (Tukey çoklu karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA) anlamlı bir farklılık gösterir. B bir başka qPCR deney 25μL hacmi toplam RNA içeren 25pg RT reaksiyonlar aşağıdaki Nurr-1 cDNA ürünü inceleyerek, bu sefer. qPCR izlerinin yanı sıra elde edilen qPCR ürün eğrisi analizi (a) erime (b) farklı karıştırma koşullar için gösterilmiştir. Hiçbir cDNA önceki RT tepki olarak dahil edildiği negatif kontrolleri de (gri izleri, "negatif") yer almaktadır. MRNA çok daha yüksek konsantrasyonlarda RT reaksiyonlar da yapılan ve (b), micromixed60 için (kırmızı izlerini) örnekleri aynı erime eğrisi zirveleri (veriler gösterilmemiştir) üretildi .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Standart laboratuvar RT reaksiyonlara micromixing uygulama yöntemi, tabii ki, tutabilen burada açıklanan herhangi bir yöntemle (örneğin, hücre parçalama, lazer yakalama mikrodiseksiyon) ile hasat mRNA. Aynı zamanda herhangi bir marka veya türleri RT reaktifleri, herhangi bir sıcaklık (micromixer malzemelerin tolerans içinde), ve herhangi bir süre oluşur. Örneğin, RT rastgele hexamer veya oligo-dT primerleri oluşan reaksiyonlar gelişmiş cDNA verim gözlemledik. Aşağıdaki kısıtlamalara uygun diğer biyokimyasal dönüşümler (örneğin, DNA hibridizasyon 15) için de uygulanabilir olabilir. Tekniğin ana kısıt reaksiyon kavisli bir sıvı-hava arayüzü (örneğin bir menisküs) küçük bir form çözümü, (mikrolitrelik) damla içinde gerçekleşmelidir. Biz rutin olarak sırasıyla 4.7 veya 6.9mm, eğrilik yarıçapları ile menisküs 200μL ince duvarlı PCR tüpleri, 10 ya da 25μL hacimleri kullanabilirsiniz. Bu, farklı çözümler arasında arayüz uzatır bırak, kurulacak bir vorteks akışı için genel bir gerekliliktir ve difüzyon daha kısa zaman ölçekleri içinde yer almasına izin veriyor. Bu sınırlama, bu nedenle micromixing olabilir tüm durumlar için geçerlidir. Aslında küçük hacimlerde kullanılması genellikle giriş malzeme (örneğin, RNA, DNA) miktarı sınırlı olduğundan bir avantaj olabilir, artı diğer ajanların önemli bir tasarruf yapılabilir. RT reaksiyon verimini geliştirmeye belirli bir bağlamda, reaksiyon da mRNA kısıtlayıcı bir değeri içermesi gerekmektedir. Biz giriş RNA tek hücreli miktarda oluşan micromixing standart laboratuvar RT reaksiyonlar (titreme, vorteks veya öğütme) karıştırma Nurr-1 resimli daha diğer genlerin de dahil olmak üzere standart yöntemler üzerinde yaklaşık 1-10 kat cDNA verimi artırdığını göstermiştir Burada 14. Biz de, bu iyileşme giriş RNA konsantrasyonu 14 arttıkça azalır göstermiştir . Muhtemelen bu yüksek RNA konsantrasyonlarda micromixing yokluğunda difüzyon artış hızı düşürür önce daha fazla mRNA cDNA dönüştürülür sağlar çünkü.
Micromixing yöntem reaksiyon çözüm tepki damar yoluyla akustik sinyal yüksek sadakat iletim yarar sağlayacaktır. Biz bunu başarmak kullanılan 200μL ince duvarlı PCR tüpleri tam uyacak şekilde konik olduğu gibi hoparlör (Şekil 1) üzerinde akrilik levha karıştırma delik dikkatli işleme yardımcı oldu. Bu tüpler ve akrilik plaka ve bu nedenle akustik sinyal iletim maksimize arasındaki temas maksimize. Bir de mekanik titreşimlerin bir sonucu olarak karıştırma sırasında gelebilir, çünkü reaksiyon tüpleri karıştırma delikleri içinde güvenli bir şekilde muhafaza edilmesini sağlamak için ihtiyacı vardır.
Bizim akustik microstreaming tanımı muhtemelen bazı fenomenolojik tabanlı tanımlar daha geniştir. Ancak, oldukça fenomenolojik, temelde bu akımları sınıflandırır Riley 16 iyi bir inceleme yoktur . Navier-Stokes denklemleri lineer olmayan vadede ortalama ikinci dereceden bir akış var ki yeterince büyük olması gerekir. Bu terimin bir hız kez hız gradyanı, biz, bir microstreaming akış ortaya çıkmasına neden olabilir hızı yeterince küçük değişen uzunluk ölçeği (yani yeterince büyük bir hız gradyanı) yapmak için bir şeyi olduğundan. Akustik microstreaming tabanlı cihaz ("micromixer") sistemi, küçük bir eğrilik 13 yarıçapı ile bir sıvı-hava arayüzü sağlayarak, ses frekansları (yani düşük güç) akustik microstreaming sağlar. Buna karşılık, "akustik akışı" çoğu zaman büyük büyük bir hız (yani yüksek güç) tarafından yapılan bir doğrusal olmayan terimi ile tanımlanır. Bizim durumumuzda, bir kuyu içinde küçük bir damla salınım yapılır; damla yüzey gerilimi, viskozite ile birlikte, 13 karıştırma için yararlı ortalama akım yaratarak bir rol oynayabilir. Deneyler ayrıca büyük (10-100μm) parçacıklar kullandığımız daha büyük titreşimli damla içinde hareket etmesinin mümkün olmadığını göstermiştir, ancak bu parçacıklar 17 özgü farklı bir mekanizma ile muhtemelen.
Sonuç olarak, tek hücreli miktarda RNA içeren standart laboratuvar RT reaksiyonlar micromixing başvuru dramatik kendi cDNA verimi artırmak için etkili bir yoldur. Bu gelişme üzerine ve karıştırma mikrolitrelik hacimleri mevcut yöntemleri (yani sallayarak, vorteks veya öğütme) kullanılarak elde edilebilir ne yukarıda. Birçok durumda olmasına rağmen yalnız micromixing RT, kendi de dahil olmak üzere, diğer şartlar, büyük bir ilerleme olacağını performans Mikroakiskan tabanlı cihazlar gerek kalmadan daha fazla özel ekipman ve yöntemler için önemli ve yeterli bir yarar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek için bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık ve Tıp Araştırma Konseyi Avustralya (proje hibe hayır °. 6.288.480) ve Scobie ve Clare MacKinnon Güven tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total RNA was isolated from snap frozen acutely prepared adult mouse midbrain slices | |||
| PicoPure RNA Isolation Kit | Arcturus Bioscience | KIT0204 | The kit is now available from Applied Biosystems |
| DNA-free DNase Treatment and Removal Reagents | Ambion | AM1906M | |
| Random hexamer primers | Promega Corp. | C1181 | |
| AMV-RT | Promega Corp. | M5101 | |
| dNTP set | Promega Corp. | U1240 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega Corp. | N2111 | |
| Nuclease-Free Water | Promega Corp. | P1193 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Hprt forward (20mer):CTT TGC TGA CCT GCT GGA TT | |||
| Hprt reverse (20mer):TAT GTC CCC CGT TGA CTG AT | |||
| Nurr1 forward (23mer):CAG CTC CGA TTT CTT AAC TCC AG | |||
| Nurr1 reverse (23mer):GGT GAG GTC CAT GCT AAA CTT GA | |||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer. | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Corbett Rotor Gene RG-6000 | Corbett Life Science | Corbett Life Science was acquired by QIAGEN in July 2008 |
References
- Livesey, F. J.
- Aumann, T. D., Gantois, I., Egan, K. Exp Neurol. 213 (2), 419-419 (2008).
- Ottino, J. M., Wiggins, S. Philos Transact A Math Phys Eng Sci. 362 (1818), 923-923 (2004).
- Losey, M. W., Jackman, R. J., Firebaugh, S. L. J Microelectromech. Syst. 11, 709-709 (2002).
- Bontoux, N., Dauphinot, L., Vitalis, T. Lab Chip. 8 (3), 443-443 (2008).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (9), 3084-3084 (2006).
- Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Anal Chem. 78 (3), 956-956 (2006).
- Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (47), 17807-17807 (2006).
- Jiao, Z. J., Huang, X. Y. Microfluidics Nanofluidics. 6, 847-847 (2009).
- Ahmed, D., Xiaole, M., Juluri, B. K. Microfluidics Nanofluidics. 7, 727-727 (2009).
- Paxton, W. F., O'Hara, M. J., Peper, S. M. Anal Chem. 80, 4070-4070 (2008).
- Autom, L. ab 11, 399-399 (2006).
- Petkovic-Duran, K., Manasseh, R., Zhu, Y. 47 (4), 827-827 (2009).
- Boon, W. C., Petkovic-Duran, K., White, K. 50 (2), 116-116 (2011).
- Liu, R. H., Lenigk, R., Druyor-Sanchez, R. L. Anal Chem. 75 (8), 1911-1911 (1911).
- Riley, N.
- Whitehill, J., Neild, A., Ng, T. W. Applied Physics Letters. 96 (5), 053501-053501 (2010).
