Invriezen van embryo's door Mouse Ethyleen Glycol-Based Vitrificatie

Summary

Een ethyleen-glycol-gebaseerde methode voor verglazing muis embryo's wordt beschreven. Is het voordelig om andere methoden in zijn eenvoud en lage embryonale toxiciteit, en kan dus worden breed toepasbaar voor vele stammen van muizen, met inbegrip van inteelt en gen-gemodificeerde muizen.

Abstract

Cryopreservatie van de muis embryo's is een technologische basis die biomedische wetenschappen ondersteunt, omdat veel stammen van muizen zijn geproduceerd door genetische modificaties en het nummer wordt consequent steeds van jaar tot jaar. De technische ontwikkeling ervan begon met langzame bevriezing methoden in de jaren 1970 ^een, gevolgd door verglazing methoden ontwikkeld in de late jaren 1980 ^2. Over het algemeen, de laatste techniek heeft als voordeel zijn snelheid, eenvoud en hoge overlevingskansen van teruggewonnen embryo's. Echter, bevatte de cryoprotectants zijn zeer giftig en kunnen vervolgens embryo-ontwikkeling beïnvloeden. Daarom is de techniek niet van toepassing op bepaalde stammen van muizen, zelfs wanneer de oplossingen afgekoeld tot 4 ° C om de toxische effect tijdens de embryonale behandeling te beperken. Op de RIKEN Bioresource Center, zijn meer dan 5000 muizenstammen met verschillende genetische achtergronden en fenotypes onderhouden ^3, en daarom hebben we een geoptimaliseerd vitrificatie technique waarmee we kunnen cryopreserve embryo's uit vele verschillende stammen van muizen, met de voordelen van een hoge overleving van embryo's na vitrifying en ontdooien (of vloeibaar, meer precies) bij de omgevingstemperatuur ^4.

Hier presenteren we een verglazing methode voor het muis embryo's die met succes is toegepast in ons centrum. De cryopreservatie oplossing bevat ethyleenglycol in plaats van DMSO om de toxiciteit te minimaliseren om embryo's ^5. Het bevat ook Ficoll en sucrose voor de preventie van devitrification en osmotische aanpassing, respectievelijk. Embryo's kunnen worden behandeld bij kamertemperatuur en overgebracht naar vloeibare stikstof binnen 5 minuten. Omdat de oorspronkelijke methode werd geoptimaliseerd voor plastic rietjes als containers, hebben we enigszins aangepast protocol voor de cryotubes, die beter toegankelijk in laboratoria en beter bestand tegen fysieke schade. We beschrijven ook de procedure van het ontdooien verglaasde embryo's tot in detail want het is een essentieel step voor een efficiënt herstel van levende muizen. Deze methoden zouden nuttig zijn om onderzoekers en technici die het behoud van muizenstammen voor later gebruik nodig hebt in een veilige en kosteneffectieve manier.

Protocol

De algemene opzet van het experiment is te zien in Fig. 1.

1. Bereiding van het reagens

1. Maak de basis medium (hier in gekend als PB1) in een 100 ml glazen fles volgens de volgende tabel hieronder:

   	MW	mM	mg/100ml
   NaCl	58,4	136,98	800,0
   KCl	74,6	2,68	20,0
   KH 2 PO 4	136,1	1,47	20,0
   Na 2 HPO 4 0.12 H 2 O	358,14	8,04	288,1
   MgCl 2, 6H 2 O	203,3	0,49	10,0
   180,2	5,56	100,0
   Na pyruvaat	110	0,33	3.6
   CaCl 2, 2H 2 O	147	0.9	13,2
   Penicilline G			6,0 (ongeveer)

2. Maak de Ficoll-sucrose (FS) oplossing:
   1. Voeg de volgende chemicaliën tot 14 ml van de PB1 oplossing in een 50 ml buis.

      Ficoll 70	6,0 g
      Sucrose	3,424 g
      BSA	42,0 mg

   2. Mix Ficoll 70 en sucrose in PB1-oplossing en schud goed totdat volledig is opgelost.
   3. Na controle volledig oplossen hierboven, tel BSA op het oppervlak van de oplossing en bewaar deze op4 oC tot de BSA volledig is opgelost (> 4 uur of een nacht).
3. Maak de equilibratie oplossing (EFS20) en de verglazing oplossing (EFS40) in een 50 ml buis:
   • EFS20: 20% (v / v) ethyleenglycol, 24% (w / v) Ficoll, en 0,4 mol / L sucrose in PB1 met BSA
   • EFS40: 40% (v / v) ethyleenglycol, 18% (w / v) Ficoll, en 0,3 mol / L ^* sucrose in PB1 met BSA
     ^* Voor embryo's uit de BALB / c of ICR-stam, verhogen de concentratie van sucrose tot 0,9 mol / L sucrose, omdat ze zijn gevoeliger voor ⁶ cryodamage.

   	EFS20 oplossing	EFS40 oplossing
   Ethyleen glycol	1 ml	2 ml
   FS-oplossing	4 ml	3 ml

4. Steriliseer de oplossing door filtratie met behulp van een 0,45 pm filter. Maak aliquots in 5 ml polystyreen buizen en bewaren bij 4 ° C. Ze kunnen worden gebruikt voor ongeveer 6 maanden.
5. Voorbereiding van de embryo ontdooien oplossing met 0,75 M sucrose (TS1)
   1. Los 7,7 g sucrose in PB1 (opgesteld in stap 1.1) en breng het totale volume tot 30 ml. Meng door zachtjes te schudden totdat sucrose volledig is opgelost.
   2. Voeg 90 mg van BSA op het oppervlak van de oplossing en laat het staan ​​totdat volledig is opgelost.
   3. Steriliseer de oplossing door filtratie.
   4. Aliquot en bewaar bij 4 ° C. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand.
   
   Opmerking: TS1 kan ook worden bereid uit commercieel beschikbare M2.
   
   6. Los 7,7 g sucrose in M2 en brengen het totale volume tot 30 ml.
   7. Meng door zachtjes te schudden totdat sucrose volledig is opgelost.
   8. Steriliseer de oplossing door filtratie.
   9. Aliquot en bewaar bij 4 oC. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand.
6. TS2 (ontdooien oplossingmet 0,25 M sucrose):
   1. Verdun 10 ml TS1 met 20 ml volume van PB1 of M2, naargelang het geval.
   2. Aliquot en bewaar bij 4 ° C. Ze kunnen gebruikt worden voor ongeveer 1 maand.

2. Verglazing van 2-cel Mouse Embryo's

1. Bereid 2-cell muis embryo's door natuurlijke dekking of conventionele in vitro fertilisatie technieken.
2. Aliquot 50 ul EFS40 in een cryotube. Hierna, voert u de rest van de verglazing procedure bij de kamertemperatuur.
3. Aliquot 50 ul van EFS20 op de bodem van een 35 mm of 60 mm plastic petrischaal.
4. Overdracht tot 30 embryo's te EFS20 met behulp van een glazen capillair met alleen het minimumbedrag van het kweekmedium. Start een timer voor 2 minuten.
   Let op: Plaats embryo's aan de onderkant van de druppel. Dit maakt een efficiënte uitdroging van embryo's. Controleer de morfologie van embryo's door een stereomicroscoop. Gedehydrateerde embryo's laten een gekrompen morfologie, zoals getoond in Fig. 2A.Als ze niet uitgedroogd genoeg zijn, wachten op meer 1 of 2 minuten.
5. Op ongeveer 1,5 min, pak de embryo's uit de EFS20 druppel met slechts het minimum van de oplossing. Overbrengen naar EFS40 in de cryotube bereid in stap 2.1. Opmerking: Voor de beste resultaten, de timing van het oppakken van embryo's zodat alle embryo's kunnen worden omgezet in EFS40 rond de 2 minuten.
6. Wacht 1 minuut.
7. Direct zet de cryotube in vloeibare stikstof (LN _2).

3. Ontdooien Verglaasd 2-cell muizenembryo's

1. Voor ontdooien, bereiden een gerecht met 10 ul druppels embryo cultuur medium voor teruggewonnen embryo's (zie stap 3.13). Bedek de schotel met olie en plaats het in een CO ₂ incubator tot gebruik. Opmerking: Hoewel alle media voor routine embryo cultuur kan worden gebruikt in dit experiment, raden we aan media met hogere osmolariteit zoals M16 medium.
2. Warm TS1 tot 37 ° C.
3. Doe een gezichtsmasker en cryogloves. Open de LN ₂ tAnk en ophalen een cryotube met embryo's.
4. Snel te openen de bovenkant van de buis en gooi LN _2. Wacht 30 seconden om te voorkomen dat TS1 tegen bevriezen de volgende stap.
5. Gebruik een 1000ul pipet tot 850 ul van TS1 (37 ° C) toe te voegen in de buis en de oplossing te mengen door voorzichtig pipettings (ongeveer tien keer in 25 seconden) tot de oplossing gelijkmatig opgelost.
6. Overdracht van het gehele volume van de buis om een plastic 60 mm petrischaal (of een horloge glas) (Fig. 3A). Let op: Embryo's moeten worden behandeld bij kamertemperatuur (22-25 ° C) tot ze worden geplaatst in een CO ₂ incubator bij stap 3.14.
7. Start een timer voor 3 minuten.
8. Op ongeveer 2 min in TS1, schud de schotel tot de medium met embryo's is verdeeld over het oppervlak van de schotel (Fig. 3B). Opmerking: Dit zal helpen de embryo's naar beneden naar de bodem, omdat ze drijven aan de oppervlakte toen overgebracht naar TS1.
9. Zet drie 50 ul druppels TS2 op ee schaal (fig. 3C).
10. Na 3 minuten in TS1, controleer dan de morfologie van embryo's door een stereomicroscoop, ze moeten licht gekrompen. Zie de morfologie van embryo's in eerdere (Fig. 2B) en later (fig. 2C) in TS1. Opmerking: Als de embryo's zijn nog steeds gezwollen, bewaar ze in TS1 voor meer 1 tot 3 minuten.
11. Pak de embryo's en overbrengen naar de eerste druppel van de TS2 (fig. 3D). Start een timer voor 3 min
12. Na 3 minuten, transfer embryo's naar de tweede te laten vallen en dan naar de derde vervolgkeuzelijst (Fig. 3E).
13. Overdracht van de embryo's aan het kweekmedium bereid bij stap 3.1. De embryo's worden in de vorm getoond in Fig. 2D.
14. Plaats schotel in een CO ₂ incubator. Ongeveer 10 min later, transfer embryo's naar de volgende druppel kweekmedium uit te spoelen sucrose die zijn overgedragen van TS2.
15. Ga verder cultuur in een CO2-incubator tot embryo transfer.
    Let op: Transfer Embryos van de eileiders van de ontvanger vrouwen op de dag van ontdooien. Lang cultuur in vitro kan verminderen de levensvatbaarheid van embryo's in sommige stammen van muizen.

4. Representatieve resultaten:

In vitro - en in vivo-ontwikkeling van embryo's na ontdooien wordt gepresenteerd in de tabellen 1 en 2. De voordelen van dit protocol zijn de hoge overlevingskansen van embryo's na ontdooien en zijn brede toepasbaarheid op verschillende stammen van muizen.

Spanning	Totaal aantal buizen	Aantal verglaasde embryo's	Voor het terugwinnen (Aantal (%))	Morfologisch normaal (Aantal (%))	Ontwikkeling tot blastocysten (Aantal (%))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / cA	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
ICR	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

Tabel 1. In vitro-ontwikkeling van verglaasd-ontdooide embryo's met elkaar gemeen muizenstammen

Toestand van embryo's	Nee van de ontvanger vrouwen	Aantal embryo's	Implantatie sites (Aantal (%))	Levende nakomelingen (Aantal (%))
Fris	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
Verglaasd	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

Tabel 2. In vivo-ontwikkeling van verglaasd-ontdooide embryo's in C57BL/6J muizen.

Figuur 1. De algemene regeling van het experiment met inbegrip van verevening, verglazing en ontdooien van embryo's.

Figuur 2. De morfologie van embryo's bij elke stap van het ontdooien.

Figuur 3. Ontdooien van embryo's. Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. (A), voeg 850 ul van TS1 (37 ° C) in een cryotube en overdracht van de gehele volume van de oplossing in de cryotube op een plastic schaaltje. Op dit moment kijken de embryo's gezwollen zoals getoond in Fig. 2B. (B), Verdeel de oplossing over het oppervlak van de schotel door zachtjes te schudden. (C), Place drie 50 pl druppels TS2 op de plastic schotel. (D), transfer de embryo's om de eerste daling van de TS2. Na 3 min, de embryo's kijk shurunken zoals getoond in Fig. 2C. (E), over te dragen seriëlely in de rest van TS2 daalt en vervolgens aan het kweekmedium.

Discussion

Sinds het eerste verslag van de muis embryo verglazing van Rall en Fahy in 1985 ^twee, hebben een aantal technische verbeteringen aangebracht in de overlevingskansen van de embryo's te verhogen na het ontdooien. Een van de meest succesvolle wijzigingen werd bereikt door het gebruik van ethyleen glycol als een cryoprotectant vanwege de lage toxiciteit en een hoge membraan-permeabiliteit. Dergelijke voordelen kunnen wij invriezen van embryo's verwerken bij kamertemperatuur ^4; andere verglazing methoden vereisen embryo inleveren bij lagere temperaturen en zijn niet altijd van toepassing zijn op bepaalde stammen van muizen waaronder BALB / c ^6. De eerste ethyleen glycol-based verglazing is ontwikkeld door Kasai et al.. in 1990 ^5,7. Omdat de oorspronkelijke methode werd geoptimaliseerd voor plastic rietjes als containers, hebben we enigszins aangepast protocol voor de cryotubes, die beter toegankelijk in laboratoria en beter bestand tegen fysieke schade. Daarom kan de verglazing hier beschreven methode wordt applicable te veel laboratoria met behulp van muizen als onderzoeksmodellen. Dezelfde methode kan ook gebruikt worden voor de muis embryo's in de morula en blastocyst fase ⁸ en rat embryo's ^9. We hebben echter recent gevonden dat de kwaliteit van cryotubes kan de overleving van embryo's van invloed zijn na invriezen en ontdooien. Zo is het essentieel om de binnenkant van de cryotubes te onderzoeken voor zijn zachtheid voor vitrifying embryo's (bijvoorbeeld, zie bij Tabel van specifieke reagentia en apparatuur).

Verglazing methoden hebben vele voordelen ten opzichte van conventionele langzaam invriezen methoden, maar ze hebben van nature een nadeel met betrekking tot het transport doel. Als verglaasde embryo's moet worden gehouden bij onder de -120 ° C om hun levensvatbaarheid te behouden, zijn droog verladers over het algemeen gebruikt voor hun veilig transport. Droge verladers zijn zwaar en omvangrijk, en hun round-trip is duur, vooral voor internationaal vervoer. We zijn nu ontwikkelt momenteel een nieuwe vitrificatie methodedie verglaasde embryo's kunnen worden opgeslagen bij droog-ijs temperatuur (ongeveer -80 ° C) gedurende ten minste zeven dagen ^10. Deze methode moet de verglazing van de volgende generatie te worden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin	Merck & Co., Inc.	12657
Ethylene glycol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Glucose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	041-00595
NaCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	191-01665
KCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	163-03545
KH2PO4	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-04245
Na2HPO4·12H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	500-04195
MgCl2 ·6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-00165
CaCl2 ·2H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	031-00435
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P-4687
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-8574
Sucrose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	196-00015
M16 medium	Sigma-Aldrich	M7292
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cryotube	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-4501	“Cryogenic Vial”