Summary
هدف هذه المقالة هو لاظهار طريقة لتحسين كشف مناعي α من مستقبلات هرمون الاستروجين (ERα) في الشرايين حنوني شرائح الفئران باستخدام المجهر الرقمي مناعي.
Abstract
وتتوسط العديد من الآثار الاستروجين على التفاعل الأوعية الدموية من خلال التفاعل مع مستقبلات الاستروجين 1 ، 2 ، 3. رغم أن عضوين أنواع فرعية موجودة (مستقبلات هرمون الاستروجين وα β) ، وقد تم التعرف على الاستروجين مستقبلات α في العضلات والسلس على حد سواء في الخلايا البطانية قطاعات الشرياني حنوني به تلطيخ الفلورسنت جنبا إلى جنب مع ليزر متحد البؤر المسح المجهري 4. علاوة على ذلك ، يقع ER - α في نوى والسيتوبلازم الشرايين القاعدي الفئران 5. المستقبلات وفيرة ويتألق الزاهية ، ولكن تصور واضح لمجموعات منفصلة من المستقبلات من الصعب على الأرجح بسبب الأعداد الموجودة في طبقات الخلية العديد من قطاعات السفينة حنوني. بالإضافة إلى ذلك ، العديد من التقارير باستخدام تقنيات المناعى يقترن المجهري مبائر سيئة بالتفصيل الاحتياجات الحرجة للاستنساخ التجارب 6. هدفنا لهذا المقال هو لوصف تقنية بسيطة لتحسين رانه تلطيخ وتصور ER - α باستخدام مستعرضة شرائح الشرايين حنوني الحصول على أدمغة الفئران من الإناث. يروي لنا first الفئران مع ايفانز صبغة زرقاء من التعرف بسهولة الشرايين السطحية حنوني الذي نحن عزل تشريح تحت المجهر. استخدام ناظم البرد لشريحة 8 أقسام ميكرومتر عبر الشرايين يسمح لنا للحصول على أقسام السفينة رقيقة جدا ان طائرات سفينة مختلفة تصور أكثر وضوحا. قطع عبر السفينة بدلا من استخدام قطعة صغيرة السفينة في الاستفادة من عرض أسهل من طبقات العضلات البطانية وسلس. بالإضافة إلى ذلك ، استخدام مجهر مناعي الرقمية مع تمديد البرنامج عمق تنتج صورا واضحة من 10-12 سفينة طائرات مختلفة وأقل كلفة من استخدام مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر.
Protocol
1. العزلة وإعداد الشرايين بيال
- في حين أن الفئران هو تخدير وتأمين ادخال قسطرة في شريان ويروي مع الأزرق ايفانز 1 ٪ في برنامج تلفزيوني 1X. سفن بيال صمة عار تماما مع صبغة زرقاء ايفانز جعلها أسهل للعزل.
- استخراج المخ وتخزينها في -70 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. على النحو الأمثل ، يجب أن تكون مخزنة العقول لا تزيد على 2 أشهر.
- باستخدام مجهر تشريح الشرايين إزالة حنوني (متوسط قطرها 35-50 ميكرون) من سطح الدماغ. سحب قبالة بعناية جميع الشرايين الزرقاء الملطخة من سطح الظهرية والجانبية من القشرة باستخدام ملقط الجميلة ذات الرؤوس. إزالة الأنسجة الزائدة القشرية ملتصقة قبل ان يضع في تثبيتي.
- إصلاح الشرايين التي تحصد في بارافورمالدهيد الباردة 2 ٪ في برنامج تلفزيوني 0.1M لمدة 30 دقيقة.
- لإعداد الشرايين لتصب sectioning المتوسطة التضمين على تجميد القرص / تشاك (وضعت في -20 درجة مئوية).
- مكان الفرع شرين منبسطة على تشوك aالثانية وانتظر حتى التجميد. المكان بقوة تصل السفينة الأيمن على القرص تجميد ناظم البرد على تضمين وسائل الاعلام مع غيض من الشريان باتجاهك. لأنه عقد مع ملاقط حتى يتم تجميد بقوة عليه.
- ضع القرص مع تجميد السفينة في الرأس ناظم البرد وقطع 8 ميكرومتر حلقات شرين حنوني مع ناظم البرد.
- تحميل المقاطع شرين على الكروم والبوتاسيوم والجيلاتين SUBBED الشرائح.
- تخزين الشرائح أعد في مربع الشريحة في الثلاجة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
2. ER - α يلطخ مناعي
اليوم 1
- إزالة الشرائح من الثلاجة ، لتحقيق كل درجة حرارة الغرفة.
- لغسل الشرائح صب 1-1،5 مل 0.1M PBS (ما يكفي لتغطية جميع الفروع) اسمحوا الجلوس لمدة 10 دقيقة ، واستنزاف وكرر الإجراء مرتين أكثر من ذلك. كل حافة الشريحة لديها علامة مسعور. وبالتالي ، يبقى السائل على سطح الشريحة. مع كل الغسيل يسكب السائلالخروج واستبدال الطازجة PBS M 0.1.
- احتضان الشرائح في 1 مل من كلوريد الأمونيوم 50mM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحد من مضان الذاتية.
- تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2
- كتلة الشرائح في 0.1 ٪ تريتون - X 100 زائد 1 ٪ مصل الماعز العادي (خ ع) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. للحد من المنظمات غير محددة وملزمة.
- احتضان العينات مع الجسم المضاد الأولي (الأرنب النسائل المتعددة المضادة للER - α ؛ 1:500) في برنامج تلفزيوني + 0.1 ٪ تريتون - X + 1 ٪ بين عشية وضحاها NGS في 4 درجات مئوية.
اليوم 2
- إزالة الشرائح من الثلاجة ، لتحقيق كل درجة حرارة الغرفة.
- تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2
- احتضان مع الأخضر ولاية أوريغون 488 أرنب الثانوية للسامية في NGS 1 ٪ +0.1 ٪ تريتون - X100 + برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. من هذه الخطوة ، يجب القيام بالخطوات التالية في الظلام.
- تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2
- لقد ظلntilated هود ، ضع قطرة من 1 4 ، 6 - 2 - diamidino phenylindole (دابي) ، بالإضافة إلى وسائل الإعلام المتزايدة على السفن ثم ضع زلة تغطي أكثر من العينة.
- تطبيق مسمار البولندية واضحة لختم حواف الغطاء زلة. لا تتحرك الشرائح حتى تجف تماما ، والتي تأخذ حوالي 24 ساعة.
3. التصوير الرقمي الإسفار
- التصوير ER - α في السفينة حنوني شريحة نستخدم الكسوف نيكون المجهر الرقمي 80i الفلورسنت مع المرشحات لمدة 3 ألوان (الأزرق والأخضر والأحمر) مجهز بكاميرا رقمية.
- تضاف شرائح محضرة مع شرائح سفينة حنوني الملون تحت المجهر وضبط لتصور المناطق fluorescently المسمى الفائدة. تبدأ عند التكبير ثم إلى زيادة X100 X600 التكبير.
- استخدام الكاميرا لالتقاط الصور في دابي (الأزرق) وFITC (الأخضر) قنوات للنواة الخلية (دابي) وER - α (أوريغون الأخضر) باستخدام نيكون التركيز العمق البرامج الموسعة لتحويل عرض متعددةق قطاعات السفينة الى 2 - D الصور.
4. ممثل النتائج :
نحن المترجمة مستقبلات هرمون الاستروجين في الأوعية الشريانية α حنوني باستخدام مسابر الفلورسنت والتصور الأمثل الذي نعيش فيه من مستقبلات باستخدام المجهر مضان الرقمية. للكشف عن وجود مستقبلات ، أرنب الضد الأولية النسائل المتعددة والخضراء ولاية أوريغون كانت تستخدم الأجسام المضادة الثانوية 488 المسمى لصورة المستقبلات في الشرايين حنوني المعزولة من سطح الدماغ. أيضا ، وهو وصمة عار النووية (دابي) كانت تستخدم لتحديد نواة الخلية وتحديد ما إذا كان بإمكاننا اكتشاف المستقبلات الموجودة في نواة منذ أن تم الإبلاغ عن ER - α أن يكون حاضرا في cyotosol الخلية والنواة. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تجارب للتحقق من صحة تأكيدي خصوصية الضد الابتدائية وملزمة للتحقق من الثانوية إلى الضد الأولية.
الشكل 1. مناعي لتلطيخ ER - α (الخضراء) وcounterstaining مع دابي (الأزرق) في حلقة الشريان حنوني المعزولة من الدماغ الفئران الإناث. ويبين الشكل 1A دمج الصور يدل على وجود بعض الاستروجين intranuclear مستقبلات - A (السهم) التين و1B 1C هي صورة مركزة من ER - α الذي هو مزيج من Z - المكدس الصور. أخذت الصور في التكبير وX600 من الحلقة قطع من السفينة نفسها في مستويين مختلفين. تشير الأسهم مستقبلات الاستروجين α.
الشكل 2. تلطيخ مناعي للمجموعات التحكم في حلقة الشريان حنوني المعزولة من الدماغ الفئران الإناث. ويبين الشكل 2D السفينة دون الضد الأولية. ويبين الشكل 2E السفينة دون الضد الثانوية (لاحظ تألق ذاتي متميزة جنبا الى جنب مع البطانية). أخذت الصور في التكبير وX600 من الحلقة قطع من السفينة نفسها في احطائرات NT.
Discussion
سابقا ، وأظهرت لنا أنه بعد عابرة العالمية إصابات الدماغ الإقفاري هو الاكتئاب بشكل ملحوظ قدرة الشريان حنوني لتغيير الإطارات استجابة لكلا موسعات 7 و 8 و 9 في الفئران vasoconstrictors ovariectomized الشباب. المزمنة امتلاء الاستروجين يستعيد ردود حركي 7-9. كذلك ، تأخر استبدال الاستروجين يعكس الآثار المفيدة لهرمون الاستروجين على توسيع الاوعيه الدمويه قدرة الشريان حنوني 10 يقودنا إلى التساؤل عما إذا استنزاف طويلة الأمد الاستروجين يؤثر ER - α الكثافة في cerebrovasculature. خططنا لاستخدام العلامات مناعي الغربية جنبا إلى جنب مع النشاف لتقييم التغيرات في التعبير ER - α استجابة لهرمون الاستروجين استنزاف المزمنة. لأن كان لدينا بعض الصعوبة في التصور مجموعات منفصلة من المستقبلات تعديل الأسلوب الذي كنا نظهر هنا. ولذلك ، كان هدفنا الأساسي في هذه الدراسة لتطوير أول طريقة بسيطة نسبيا لتحسين البصرسعودة من المستقبلات في الشرايين حنوني. في اتفاق مع عدة تقارير 6،11،12 وجدنا أنه من الضروري إجراء تعديلات لنوع من الأنسجة كنا التحقيق ، وسماكة العينة ، وتوزيع ER - α في السفينة ، فضلا عن درجة غير محددة وملزمة .
لدينا وسيلة فعالة جدا لتصور وجود ER - α في شرائح حنوني السفينة. ولكن كما سبق وأشار آخرون إلى نجاح استخدام هذه الأساليب تعتمد بشكل كبير على نوعية وتركيز الأجسام المضادة ، ومكان التحت خلوية من البروتينات التثبيت والفائدة والبروتوكولات وحظر التعامل مع النسيج 12. قبل التصور الاستعدادات السفينة قضينا لدينا الوقت للعمل على كل هذه المتغيرات. وأبرزت كيف أننا كنا في حاجة إلى تعديل بعض من نهجنا في هذه الورقة.
حددنا لتصور مثالي ER - α في الشرايين حنوني وهذا قدم بعض التحديات.أولا ، بلغ متوسط حجم الشريان الفئران حنوني ما بين 35-50 ميكرومتر صنع العزلة وإزالة من سطح الدماغ صعبة بعض الشيء. وجدنا أن نضح مع ايفانز صبغة زرقاء قبل التضحية يجعل من السهل تشريح الشرايين. يمكن أن تؤثر على الأزرق ايفان مضان ، لكننا نرى أن الاستفادة من استخدام هذه الصبغة تفوق سلبياته طفيفة. في بروتوكول لدينا هي تغسل سفن عدة مرات. هذا يقلل من الصبغة المتبقية في السفن ، ويقلل من الآثار المحتملة للصباغة على مضان. وقد واجهنا صعوبة أخرى أن سمك شرائح حنوني السفينة التي تصور واضح لمستقبلات صعبة. بالإضافة إلى ذلك ، لم نتمكن من الحصول على صور واضحة على نحو خاص بسبب الأرجح إلى حقيقة أن تناثرت ER - α طوال عدة طبقات الخلية. حاولنا العمل مع شرائح طولية السفينة (كما فعل آخرون) ، ولكن نظرا لحجم حنوني الصغيرة كان من الصعب التعامل مع السفن ومنع السفن من التواء في حين تصاعدحتى على الشرائح باستخدام المجهر. أخيرا ، فإننا تعديل بنجاح أسلوبنا باستخدام ناظم البرد وقطع السفينة العابرة للحكيم في لحلقات 8 ميكرومتر سميكة. الحلقات هي أسهل في التعامل معها ويمكن تركيبه على عدة شريحة واحدة.
حصلت مرة واحدة ونحن السفن شعرنا أنه من الضروري اختبار فعالية فلاش first تجميد الأنسجة ثم إصلاح السفن ، كما اقترح Danseshatalb والزميلة 11. على الرغم من أن وجدنا أقل هامشيا المناعي الخلفية ، لاحظنا أيضا أن مستقبلات أقل الملون بشكل مكثف مما تصور من مستقبلات أكثر صعوبة. وبالتالي ، فإننا نفضل أن أول من تجميد كامل الدماغ وتخزينها لحين الحاجة إليها (بين عموما 1-2 أشهر). نحن ثم سحب السفن قبالة صفه وإصلاح السفن قبل التقطيع مع ناظم البرد. كما علينا أن نظهر هنا.
خطوة واحدة اللازمة لتشغيل الضوابط الأولية مع كل من وحدة الأضداد الثانويةلتحديد نوعية وخلفية المناعي. الاستروجين يمكن أن الأجسام المضادة لمستقبلات α يكون من الصعب التعامل معها. في الواقع ، حاولنا 3 الأجسام المضادة الأولية مختلفة (1 حيدة النسيلة والنسائل المتعددة 2) قبل كانوا راضين نحن مع نجاح تلطيخ مستقبلات لدينا. كجزء من الرقابة لدينا ونحن أول من التحقق من نوعية الأجسام المضادة الأولية عن طريق السهو من إضافة الأجسام المضادة الأولية. ويبين الشكل 2D السفينة دون الضد الأولية. لا يوجد أي تلطيخ ومجرد إشارة الخلفية قليلا. منذ الضد الرئيسي هو النسائل المتعددة ، هناك بعض منتشر تلوين الخلفية غير محددة. ثانيا ، قمنا بإضافة الأجسام المضادة الأولية ، ولكن ليس على الأجسام المضادة الثانوية (الشكل 2E) يمكن للمرء أن يرى هامشا لطيفة تمثل autofluoresence على طول الحدود البطانية للأوعية الدموية. وهذا يتفق مع العمل والزميلة دان 5. ومع ذلك ، فإن أيا من نقاط صغيرة من المناعي التي تمثل ER - α ، ولا المرجع ظهور حبيباتيمكن lecting وجود العديد من المستقبلات دون أن يتم الكشف عن مجموعة من الأجسام المضادة في المرحلتين الابتدائية والثانوية. لاحظنا وجود نمط متميز من autofluoresence على طول هوامش البطانية للأوعية الدموية. هذه التجارب المستقلة لخصوصية جسم مهمة لأنها تؤكد خصوصية الضد لER - α والأجسام المضادة الثانوية بربط الأولية.
في الختام ، كما يتبين من قبل الآخرين 4 و 5 الأوعية الدموية في الدماغ تحتوي على العديد من ER - α النوع الفرعي المستقبلات. في أيدينا ، وإعداد 8μm شرائح مقطعية عرضية من الشرايين حنوني معزولة يعزز تلطيخ وتصور من المستقبلات. استخدام الطرق التقليدية المجهري مبائر لفحص العينات. لديها القدرة لعرض مقاطع من المسلسل البصرية العينات سميكة هو المهم الاستفادة من المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، يمكن شراء مجهر مبائر جيد أن تكون مكلفة جدا. باستخدام الموسعة العمق (EDF) والبرمجيات ، وجدنا أنيمكن أن تقلل من تكاليف المعدات لدينا. باستخدام المجهر الفلورسنت مع EDF حصلنا على صور واضحة وقادرة على تصور حنوني الشرياني ER - α على عدة مستويات باستخدام Z - المداخن. وهناك فائدة كبيرة من البرامج EDF هو أنه يسمح التقاط الصور بطريقة فعالة لخلق صورة 3 - D من الصور. ربما للمختبرات التي لا يستطيعون الوصول إلى مجهر مبائر أو الأموال لشراء واحدة المجهر الرقمي الفلورسنت مع البرامج المخصصة يكون خيارا عمليا وأقل تكلفة وفقا لأهداف محقق.
Disclosures
الآراء التي أعرب عنها هي تلك التي من المؤلفين ولا تعكس السياسة الرسمية أو الموقف من جامعة الخدمات الموحدة لعلوم الصحة ، وزارة الدفاع ، أو حكومة الولايات المتحدة.
Acknowledgments
وأيد العمل لهذا المشروع من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة R01 - NR5339 وجامعة الخدمات الموحدة للعلوم الصحية ، R061LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z.
