Summary
Bu makalenin amacı, dijital bir immunofluorescent mikroskop kullanılarak sıçan pial arteriyel dilim östrojen reseptör-α immunofluorescent algılama (ERα) optimize etmek için bir yöntem göstermektir.
Abstract
Birçok vasküler reaktivite östrojen etkileri, östrojen reseptörleri 1, 2, 3 ile etkileşimi aracılığıyla . Iki alt türleri (östrojen reseptör-α ve β) mevcut olmasına rağmen, östrojen reseptör-α hem düz kas ve endotel hücreleri konfokal lazer tarama mikroskopisi 4 ile birlikte floresan boyama kullanarak pial arter segmentlerinin tespit edilmiştir. Ayrıca, ER-α çekirdekleri ve sıçan baziler arterler 5 sitoplazmasında yer almaktadır. Bol reseptörleri ve parlak floresan, ancak ayrık gruplar reseptörler açık görselleştirme olasılıkla pial damar segmentinin birçok hücre katmanları bulunan numaralar nedeniyle zordur. Ayrıca, immünohistokimyasal teknikler kullanarak çok sayıda rapor kötü konfokal mikroskopi ayrıntılı deneyler 6 çoğaltılması için kritik gereksinimleri ile eşleştirilmiş. Bu makalede amacımız t optimize etmek için basit bir tekniği tarif etmek içinER-α boyama ve görselleştirme, kadın sıçan beyinlerinde elde pial arteriyollerin kesitsel dilim kullanarak. Önce bir diseksiyon mikroskobu altında izole yüzey pial arterler kolaylıkla belirlemek için Evans mavi boya ile sıçan serpmek. Arterlerin 8 mikron kesitler dilim Kriyostat farklı gemi uçaklar daha net görselleştirildiği ince damar bölümleri elde etmek için sağlar. Küçük bir damar segmentinin kullanmak yerine gemi boydan boya kesen, endotelyal ve düz kas tabakaları daha kolay izleme bir avantaja sahiptir. Buna ek olarak, uzun derinliği yazılım 10-12 farklı damar uçakların net görüntüler üretir ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanımı daha az masraflı olan bir dijital immunofluorescent mikroskop kullanımı.
Protocol
1. İzolasyon ve Hazırlık pial Arterler
- Sıçan, anestezi eklemek ve 1 1X PBS içinde% Evans mavisi ile bir arter ve serpmek içine bir kateter güvenli iken. Pial damarların daha kolay izole Evans mavi boya ile leke.
- Gerekli ° C kadar -70 beyin ve mağaza ayıklayın. Optimal, beyinleri, artık 2 ay daha saklanmalıdır.
- Diseksiyon mikroskop kullanarak beynin yüzey pial arteriyollerin (ortalama çapı 35-50 mikron) çıkarın. Dikkatlice ince uçlu forseps kullanarak korteksin dorsal ve lateral yüzeyinden tüm mavi lekeli arteriyollerin çekin. Fiksatif yerleştirmeden önce aşırı yapışık kortikal doku çıkarın.
- % 2 0.1M PBS içinde 30 dakika süreyle soğuk paraformaldehid hasat arteriyollerin sabitleyin.
- Kesit için arteriyollerin hazırlamak için disk donma / mandren (-20 ° C'de) gömme orta dökün.
- Chuck düz Place arteriyol bölümünde And dondurmak için bekleyin. Size dönük olacak şekilde arter ucu ile medya gömme Kriyostat dondurma diskte sıkıca geminin yere kadar doğru. Cımbız ile sağlam donmuş kadar tutun.
- Kriyostat kafasının içine gemi ile donma disk yerleştirin ve Kriyostat ile 8 mikron pial arteriyol halkaları kesmek.
- Krom-potasyum-jelatin Altyazılı slayt Mount arteriyol bölümleri.
- 4 ° C gecede hazırlanan slaytlar slayt kutusunda buzdolabında saklayın.
2. ER-α Immunofluorescent Boyama
1. Gün
- Slaytlar buzdolabından çıkarın, oda sıcaklığında her getirmek.
- Slaytları yıkamak için 1-1.5 ml 0.1M PBS (tüm bölümleri kapsayacak şekilde), 10 dakika boyunca oturup, drenaj ve iki kat daha fazla işlem tekrar dökün. Slayt her kenarı hidrofobik bir belirteç vardır. Sonuç olarak, slayt yüzeyinde sıvı kalır. Her yıkama sıvı dökülürve taze 0,1 M PBS ile değiştirilir.
- Endojen floresan azaltmak için 50mm amonyum klorür 30 dakika oda sıcaklığında 1 ml slaytlar inkübe edin.
- 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 'de açıklandığı gibi
- % 0.1 Triton-X 100 artı, 30 dakika süreyle PBS% 1 normal keçi serumu (NGS) Blok slaytlar. non-spesifik bağlama azaltmak için.
- Örnekleri PBS +% 0.1 Triton-X geceleme 4 +% 1 NGS ° C; primer antikor (1:500 tavşan poliklonal anti-ER-α) ile inkübe
2. Gün
- Slaytlar buzdolabından çıkarın, oda sıcaklığında her getirmek.
- 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 'de açıklandığı gibi
- % 1 NGS karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat boyunca% 0,1 Triton-X100 + PBS Oregon Green 488 ikincil anti-tavşan ile inkübe edin. Bu adım, bir sonraki adımları karanlıkta yapılmalıdır.
- 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 'de açıklandığı gibi
- Ve altındantilated davlumbaz, 4 'yerine 1 damla, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) artı sonra montaj gemilerin medya ve numune üzerinden bir kapak slip yerleştirin.
- Kapak kayma kenarları mühür Açık tırnak cilası sürün. Yaklaşık 24 saat sürer slaytlar, tamamen kuruyana kadar hareket etmeyin.
3. Dijital Floresans Görüntüleme
- Pial damar görüntüleme ER-α biz bir dijital kamera ile donatılmış 3 renk (mavi, yeşil ve kırmızı) için filtreler ile Nikon Eclipse 80i dijital floresan mikroskop kullanmak dilim için.
- Lekeli pial damar kesimleri ile mikroskop altında hazırlanan slaytlar takın ve ilgi floresan ile işaretlenmiş alanları görselleştirmek için ayarlamak. Sonra x600 büyütme artış x100 büyütme başlayın.
- Çoklu görünüm dönüştürmek için DAPI (mavi) ve hücre çekirdekleri (DAPI) ve Nikon Genişletilmiş Derinlik Odak yazılımı kullanarak ER-α (Oregon Yeşil) FITC (yeşil) kanalları görüntüleri yakalamak için fotoğraf makinesini kullanın2-D görüntü içine damar segmentlerinin.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Biz flüoresan millerini kullanarak pial arter damarlarında lokalize östrojen reseptör-α ve reseptör dijital floresan mikroskobu kullanarak görselleştirme optimize. Reseptör, bir tavşan poliklonal primer antikor ve bir Oregon Green 488 etiketli ikincil antikor görüntü beynin yüzey izole pial arterlerde reseptörleri için kullanılan varlığını saptamak için. Ayrıca, nükleer bir leke (DAPI) hücre çekirdekleri tespit ve ER-α hücre cyotosol ve çekirdeğinde bulunan rapor beri çekirdeğinde bulunan reseptörleri tespit eğer belirlemek için kullanılmıştır. Buna ek olarak, birincil antikor özgüllüğü doğrulamak ve doğrulayıcı birincil antikor ikincil bağlayıcı doğrulamak için deneyler yaptılar.
Şekil 1 Immunofluorescent ER-α için boyama (yeşil) ve kadın sıçan beyin izole bir pial arter halka DAPI (mavi) ile counterstaining. Şekil 1A, bazı intranükleer östrojen varlığını düşündüren Birleştirilen görüntülerin reseptör-a (ok). Şekil 1B ve 1C, Z-yığın görüntüler bir arada ER-α odaklı görüntü. Görüntüler x600 büyütme ve farklı düzlemlerde aynı geminin kesim halka. Oklar östrojen reseptör-α göstermektedir.
Şekil 2 kadın sıçan beyin izole bir pial arter halka kontrol grupları için Immunofluorescent boyama. Şekil 2D primer antikor olmadan geminin gösterir. Şekil 2E ikincil antikor olmadan (endotel tarafı boyunca notu farklı otofloresans) damar gösterir. Görüntüler x600 büyütme ve differe aynı geminin kesim halkant uçaklar.
Discussion
Daha önce, geçici global iskemik beyin hasarı sonrası vazodilatörler 7, 8 ve vazokonstriktörlere 9 yanıt olarak çapını değiştirmek için pial arter kapasitesi belirgin genç ovarektomize sıçanlarda depresif olduğunu gösterdi. Kronik östrojen replasmanı vazomotor yanıtları 7-9 geri yükler. Ayrıca, östrojen replasman gecikme, bize uzun süreli östrojen eksikliği cerebrovasculature ER-α yoğunluğu etkileyip etkilemediğini sorgulamaya yol açan pial arter vazodilatör kapasitesi 10 östrojen yararlı etkilerini tersine çevirir . Biz batı kronik östrojen tükenmesi yanıt ER-α ifade değişiklikleri değerlendirmek için blot ile birlikte immunofluorescent etiketleme kullanılması planlandı. Reseptörleri ayrık gruplar görselleştirme bazı zorluk vardı Çünkü biz burada göstermek yöntemi değiştirilebilir. Bu nedenle, bu çalışmada birincil hedefimiz ilk görsel optimize etmek için nispeten basit bir yöntem geliştirmek içinpial arteriollerde reseptörleri Ag + referans. Çeşitli raporlar ile anlaşma 6,11,12 biz problama doku tipi için ayarlamalar, örnek kalınlığı, gemi ER-α dağılımı yanı sıra non-spesifik bağlayıcı derecesi yapmak için gerekli bulundu. .
Bizim metodumuz pial gemi dilimleri ER-α varlığı görselleştirmek için çok etkili. Ancak diğerleri bu yöntemlerin başarılı kullanımı, daha önce belirttiğimiz gibi antikorların özgüllük ve konsantrasyonları, faiz, fiksasyon ve engelleme protokolleri ve doku taşıma 12 proteinlerin hücre içi konumu son derece bağlıdır. Geminin hazırlıkları görselleştirme önce biz tüm bu değişkenler zaman geçirdim. Biz nasıl biz bu yazıda bazı yaklaşım ayarlamak için gerekli sermiştir.
Optimal pial arteriyollerin ER-α görselleştirmek için yola çıkan ve bu birkaç zorluklar sundu.Birincisi, bir sıçan pial arter ortalama büyüklüğü 35-50 mikron arasında beyin yüzeyinden izolasyon ve çıkarılması biraz zor. Biz Evans mavi boya öncesi kurban etmek daha kolay damar diseksiyonu yapar perfüzyon bulundu. Evan mavi floresan etkileyebilir, ancak biz bu boya kullanılarak avantajı küçük dezavantajları fazla olduğunu hissediyorum. Protokolde gemilerin birkaç kez yıkanır. Bu gemilerin içinde kalan boya ve floresan boya olası etkilerini en aza indirir azaltır. Karşılaştığımız bir diğer zorluk pial damar segmentlerinin kalınlığı zor reseptörler açık görselleştirme yapılmış olmasıydı. Ayrıca, muhtemelen birçok hücre katmanları ER-α dağılmış olduğu gerçeğini nedeniyle, özellikle net görüntüler elde edemezler. Uzunlamasına damar dilimleri (diğerleri gibi) ile çalışan çalıştı, ancak montaj sırasında küçük pial boyutu nedeniyle gemilerin işlemek ve gemilerin sıkılmasını önlemek zorduhatta bir mikroskop kullanılarak slides on. Son olarak, başarılı bir Kriyostat kullanarak ve 8 mikron kalınlığında halkalar çapraz damar kesme tekniği değiştirilmiş. Halkalar kolay ve çeşitli bir slayt monte edilebilir.
Bir kere biz, biz sonra gemilerin tespit Danseshatalb ve ark 11 tarafından önerilen doku dondurma ilk flaş etkinliğini test etmek üzere gerekli hissettim gemilerin satın aldı . Marjinal olarak daha az arka plan immünofloresan rağmen, biz de reseptörleri daha az yoğun görselleştirme reseptörlerinin daha zor hale boyanmış olduğunu kaydetti. Sonuç olarak, (genellikle 1-2 ay arasında) kadar gerekli tüm beyin dondurmak ve saklamak için ilk tercih. Daha sonra gemilerin açıklandığı gibi çekin ve gemilerin Kriyostat dilimleme önce düzeltmek. Burada göstermek gibi.
Bir birincil ve ikincil antikor ayrı ayrı hem de denetimlerini çalıştırmak için gerekli bir adımözgüllük ve arka plan immünofloresan belirlemek için. Östrojen reseptör-α antikorları ile çalışmak zor olabilir. Reseptör boyanması başarı ile memnun önce Aslında, biz 3 farklı birincil antikorlar (1 monoklonal ve poliklonal 2) çalıştı. Kontrollerin bir parçası olarak, öncelikle birincil antikor yanı sıra ihmal birincil antikor özgüllük doğrulandı. Şekil 2D primer antikor olmadan geminin gösterir. Herhangi bir boyama ve sadece küçük bir arka plan sinyali vardır. Birincil antikor poliklonal olduğundan, bazı diffüz non-spesifik bir arka plan boyama vardır. İkincisi, biz birincil antikor eklendi, ancak ikincil antikor (Şekil 2E). Bir damarların endotel sınırları boyunca autofluoresence temsil eden güzel bir marj görebilirsiniz. Bu çalışma ile Dan ve iştirakçi 5 tutarlı. Ancak, ER-α temsil immünofloresan küçük noktaların, ne de granüler bir görünüm ref nesayısız reseptörlerinin varlığı lecting birincil ve ikincil antikorlar hem de birleşimi olmadan tespit edilebilir. Biz farklı bir desen damarların endotel kenarları boyunca autofluoresence kaydetti. ER-α antikor özgüllük onaylamak ve ikincil antikor birincil bağlar antikor özgüllük Bu bağımsız testler önemlidir.
Sonuç olarak, diğerleri 4 gösterdiği gibi, 5 beyin kan damarları çok sayıda ER-α alt-tipi reseptörler içerir . Bizim ellerde, izole pial arterlerden 8μm kesit dilimleri hazırlanıyor reseptörlerinin boyama ve görselleştirme artırır. Geleneksel yöntemler örnekleri incelemek konfokal mikroskopi kullanın. Konfokal mikroskopi kalın kesitlerle seri optik bölümleri görüntülemek için kapasitesine sahip önemli bir yararı. Ancak, iyi bir konfokal mikroskop satın alma, çok pahalı olabilir. Genişletilmiş Derinlik (EDF) yazılımı kullanılarak, biz bulundu.ekipman maliyetleri azaltabilir. EDF ile floresan mikroskop kullanarak, net görüntüler elde edilir ve Z-yığınları kullanarak çeşitli düzeylerde pial arteriyel ER-α görselleştirmek mümkün. EDF yazılım önemli bir yararı, bir şekilde etkili görüntüleri 3 boyutlu bir resim oluşturmak için görüntü yakalama izin verir. Konfokal mikroskop ya da fonların bir tahsis yazılımı ile dijital floresan mikroskop satın almak için erişimi olmayan laboratuarlar için araştırmacının hedeflerine bağlı olarak pratik ve daha az maliyetli bir seçenek olabilir.
Disclosures
Ifade edilen görüşler yazarlarına aittir ve üniformalı Hizmetler Sağlık Bilimleri Üniversitesi, Savunma Bakanlığı, ya da Amerika Birleşik Devletleri hükümeti, resmi politika veya konumunu yansıtmamaktadır.
Acknowledgments
National Institutes of Health R01-NR5339 hibe ve Sağlık Bilimleri R061LD üniformalı Hizmetleri Üniversitesi tarafından desteklenen bu proje için çalışma oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EVANS BLUE | Sigma-Aldrich | E-2129 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P-5493 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353 | |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | VWR international | 25608-930 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| ER-α rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | H-184 | |
| Oregon green 488 goat anti rabbit IgG | Invitrogen | O-11038 | |
| Vectashield mounting medium for fluorescence with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Smiley, D. A., Khalil, R. A. Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels. Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).
- Miller, V. M., Duckles, S. P. Vascular actions of estrogens: functional implications. Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).
- Duckles, S. P., Krause, D. N. Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action. Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).
- Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).
- Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).
- Fritschy, J. M. Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry. Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).
- Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation. Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).
- Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP. Microcirculation. 16, 403-413 (2009).
- Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery. Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).
- Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity. FASEBJ Abstracts. , (2007).
- Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies. J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).
- Lorincz, A., Nusser, Z.
