Summary
Utformingen av en grei en dag arbeidsflyt ordning for bakterielle patogen diagnostikk muliggjør rask anerkjennelse av blodet infeksjoner. Inkludering av åtte klinisk relevante bakterielle mål og deres antibiotikaresistens profiler gir klinikeren en innledende innsikt på samme dag, noe som kan føre til mer adekvat behandling.
Abstract
Blodet infeksjoner er forbundet med høy dødelighet på grunn av den sannsynlige manifestasjonen av sepsis, alvorlig sepsis og septisk sjokk en. Derfor er rask administrasjon av adekvat antibiotikabehandling av fremst betydning i behandlingen av infeksjoner i blodbanen. Den kritiske element i denne prosessen er timing, sterkt avhengig av resultatene av bakteriell identifikasjon og antibiotika resistenstesting. Begge disse parametrene er rutinemessig innhentet av kultur-testing, noe som er tidkrevende og tar i gjennomsnitt 24-48 timer 2, 4. Målet med studien var å utvikle DNA-baserte analyser for rask identifisering av blodet infeksjoner, samt rask antimikrobiell resistenstesting. Den første analysen er en eubacterial 16S rDNA-basert real-time PCR analysen supplert med arts-eller genus-spesifikke probene 5. Ved hjelp av disse probene, Gram-negative bakterier, inkludert Pseudomonas spp.., Pseudomonas aeruginosaog Escherichia coli, samt Gram-positive bakterier, inkludert Staphylococcus spp.., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp.., Streptococcus spp.., og Streptococcus pneumoniae kan skilles. Ved hjelp av denne multiprobe analysen, ble en første identifisering av utløsende mikroorganismen gitt etter 2 timer.
Dernest har vi utviklet et semi-molekylær analyse for antibiotika resistenstesting av S. aureus, Enterococcus spp.. og (fakultativ) aerobe Gram-negative staver 6. Denne analysen var basert på en studie hvor PCR ble brukt til å måle veksten av bakterier 7. Bakterier høstet direkte fra blodkulturer inkuberes i 6 timer med et utvalg av antibiotika, og etter en SYBR Green-basert real-time PCR analysen bestemmer hemming av vekst. Kombinasjonen av disse to metodene kan lede valget av en passende antibiotikabehandling på samme dag (Figur 1). I konklusjonen, Molekylær analyse av både identifikasjon og antibiotika mottakelighet tilbyr et raskere alternativ for deteksjon av patogen og kunne forbedre diagnostikk av infeksjoner i blodbanen.
Protocol
DEL I: Patogen IDENTIFIKASJON
1. Prøvepreparering
Merk: Hele molekylære arbeidsflyten som er beskrevet i følgende protokoll skal utføres i henhold til anbefalinger for kvalitetssikring i molekylær diagnostikk tre.
- Legg en 0,1 ml delmengde av blod kultur til 0,9 ml 0,9% NaCl til en 1,5 ml reaksjonsrøret å bli en 1:10 fortynnet prøve. (Fortynn for å hindre qPCR hemming).
- Sentrifuger prøven på 13 400 xg i 5 min til pellet bakteriell DNA.
- Resuspender bakteriell pellet i 100 mL sterilt destillert H 2 O.
- Oppbevar DNA-prøven ved 4 ° C inntil videre bruk.
2. Identifikasjon Assay: Real-time 16S rDNA PCR
- Forbered reaksjonsblandingene som følger. Analysen består av fire separate reaksjoner per prøve. Hver blanding omfatter 12,50 mL mestermix, 0,9 mM forward primer (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, 0,6 mM reverse primer (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 og et panel av sonder. Mengden av sonder gis for hver av de fire separate reaksjoner i nedenfor.
- Den første reaksjonen omfatter:
- 0,2 mM universalsonden (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8
- 0,2 mM P. aeruginosa probe (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1)
- Den andre reaksjonen omfatter:
- 0,2 mM E. coli probe (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1)
- 0,2 mM Pseudomonas spp.. probe (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ)
- Den tredje reaksjonen omfatter:
- 0,2 mM Staphylococcus spp.. probe (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ)
- 0.2 mM S. aureus probe (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1)
- 0,2 mM Enterococcus spp.. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1)
- Den fjerde reaksjon omfatter:
- 0,2 mM universalsonden (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1)
- 0,3 mM Streptococcus spp.. probe (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ)
- 0.2 mM S. pneumoniae probe (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1)
- Legg steril demineralisert H 2 O til å nå et totalt volum på 20 mL. Tilsett 20 mL av hver reaksjonsblandingen til brønnene til en 96-brønns PCR plate.
- Tilsett 5 mL av prøven til hver brønn.
- Bruk en selvklebende film for å forsegle 96-brønnen PCR plate.
- Kjør platen på ABI PRISM 7900HT Real Time PCR System ved hjelp av følgende optimale termiske sykkelforholdene:
- Pre-oppvarming ved 50 ° C i 10 min
- Initial denaturering ved 95 º C i 15 min
- 42 sykluser med
- Denaturering ved 95 º C i 15 s
- Annealing ved 60 ° C i 1 min
3. Analyse av resultatene
Juster terskelen til Ct Analysis til 0,1 i kategorien Analysis innstillinger. Begrense baseline konfigurasjoner for å starte (Cycle): 6 og End (Cycle): 15.
- Noter syklusen terskel (Ct) verdi for alle prøvene. Cut-off verdi for å vurdere en PCR resultat som positivt kan settes til en Ct-verdi på 35. Mengden av bakterier i blodkulturer varierte fra 10 juli til 10 november CFU / ml, genererer Ct-verdier under 35.
DEL II: antibiotika resistenstesting
4. Isolering av bakterier fra Positive blodkulturer 9
- Sug 5 ml kjøttkraft fra en positiv blodkultur flaske og overføre den til en serum separator tube.
- Sentrifuger serum separator røret ved 2000 xg i 10 min.
- Kast supernatanten fra serum separator tube.
- Transfer bacTeria fra gellaget av røret med en steril bomullspinne i 0,9% saltløsning til en 0,5 McFarland standard suspensjon oppnås.
5. Inokulering av Micro titer Plater
- Fortynn 0,5 McFarland suspensjon i dobbel konsentrert Mueller Hinton II kjøttkraft å danne en suspensjon av 5 x 10 5 CFU / ml.
- Legg denne suspensjonen til brønnene til en mikro titer plate inneholder et utvalg av antibiotika (Tabell 1).
- Inkuber mikro titer platen ved 37 ° C i 6 timer.
- Oppbevar en delmengde av suspensjonen ved 4 ° C (som negativ vekst kontroll).
- Etter seks timers inkubering, overføre innholdet av hver brønn i et sterilt rør, samt den negative veksten kontrollutvalget som var lagret ved 4 ° C.
- Sentrifuger rørene på 16 000 xg i 5 min.
- Fjern forsiktig supernatanten, uten å forstyrre den bakterielle pellet.
- Resuspender kulen i sterile demineralisert H
- Fortynn prøvene 10 ganger i sterilt destillert H 2 O.
6. Sanntids 16S rDNA PCR-10
- Klargjør PCR blanding som følger:
- 12.50 mL iQ SYBR Grønn Supermix
- 0,5 mM forward primer 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11
- 0,25 mikrometer revers primer 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11
- sterile demineralisert H 2 O til et totalt volum på 20 mL
- Tilsett 20 mL av PCR blandingen til brønnene til en 96-brønns PCR plate.
- Tilsett 5 mL av prøven til hver brønn.
- Bruk en selvklebende film for å forsegle 96-brønnen PCR plate.
- Kjør platen på MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, ved hjelp av følgende optimale termiske sykkelforholdene:
- Initial denaturering ved 95 º C i 4 min
- Initial annealing ved 65 ° C for 30 s
- 35 sykluser med
- Denaturering ved 95 ° C i 15 s
- Annealing ved 60 ° C i 1 min
- Smelt kurve analyse (60-95 ° C i 20 min med intervaller på 0,57 ° C)
7. Analyse av resultatene
- Beregn cut-off Ct-verdien ved hjelp av én av følgende formler (avhengig av type antibiotika).
- Generelt:
Cut-off Ct-verdi = Ct-verdien positiv vekst kontroll + 0,5 x (Ct verdi negativ vekst kontroll - Ct verdi positiv vekst kontroll) - Piperacillin, Piperacillin / Tazobactam og ceftazidim i Gram-negative staver, Amoxicillin, oxacillin og trimetoprim / sulfametoksazol i S.aureus, Amoxicillin i Enterococcus spp.:. Cut-off Ct-verdi = Ct-verdien positiv vekst kontroll + 0,25 x (Ct verdi negativ vekst kontroll - Ct verdi positiv vekst kontroll)
- Generelt:
- Bruk prøven inkuberes med steril demineralisert H 2 O som positiv vekst kontroll.
- Avhengig av mikroorganismen, bruke riktig negativ vekst kontroll:
- Gram-negative staver Sample inkubert med blanding av antibiotika
- Enterococcus spp.. Prøve som er lagret ved 4 ° C
- S.aureus prøve som er lagret ved 4 ° C
- Bestem mottakelighet (S) eller motstand (R) av belastningen for den testede antibiotika som følger:
- En CT verdi høyere enn cut-off Ct-verdien angir mottakelighet
- En CT verdi lavere enn cut-off Ct-verdi indikerer motstand
8. Representative Resultater
To modellorganismer, dvs. en Gram-negative E. coli og en Gram-positive S. aureus, er valgt for å visualisere den kombinerte metode for påvisning og identifikasjon av bakterielle patogener og bestemmelse av deres antimikrobielle profil. Den første delen av protokollen omfatter patogen identifikasjon. Spekrete prober er designet for påvisning av åtte klinisk relevante mikroorganismer. I nærvær av et mål inkludert i bakteriell panelet, er forsterkningsbehov kurver generert og Ct-verdier beregnes (Figur 2). Cut-off verdi for å vurdere en PCR resultat som positivt er satt til en Ct verdi på 35. I figur 2A, er identifisering profilen en E.coli-infisert blod kultur vist. Den 16S universalsonden er inkludert i to separate reaksjonsblandingene og dermed genererer to forsterkningsbehov kurver (Ct på 25,20 og 25,95). Den tredje signalet er avledet fra sonden spesifikk for E. coli (Ct av 27,04). Identifiseringen av en S. aureus-infisert blod kultur er vist i figur 2B. Den 16S universalsonden har forsterkningsbehov signaler fra 33.35 og 33.71. De to resterende signalene kommer fra sondene spesifikke for Staphylococcus spp.. og S. aureus (Ct av 32.48 og 30.59).
Figur 3 er et eksempel på en antibiotika resistenstesting forsterkning plott, representerer E.coli stamme som også ble vist i figur 2A. Hver linje representerer en antibiotika at bakteriell prøven ble inkubert med. En prøve med en lav Ct verdi er et eksempel der veksten har skjedd i nærvær av et antibiotikum, indikerer motstand mot testet antibiotika. Tvert imot representerer en høy Ct verdi en prøve der ingen vekst har oppstått på grunn av effektiv utnyttelse av antibiotika, noe som indikerer mottakelighet for de testede antibiotika. Tabell 1 viser bestemmelse av antimikrobielle profilen til E. coli og S. aureus isolater. Alle Ct-verdier rapporteres og ved hjelp av formler nevnt i protokollen tekst (7.1), to cut-off Ct verdier er beregnetlert å skille mellom resistens og følsomhet. Belastningen er resistente mot antibiotika dersom rapporterte Ct-verdien er lavere enn beregnet cut-off Ct-verdi (og vice versa).
Figur 1. Flytskjema av organismen identifikasjon og antibiotika resistenstesting prosedyren med sanntids-16S rDNA PCR.
Figur 2 Identifikasjon analysen:. Forsterkning plott og sykkelveier grenseverdier (CT verdier) En positiv blodkultur er oppdaget av den universelle 16S rDNA probe, mens de spesifikke probene brukes for identifisering av den kausale patogen.. A. forsterkning tomt på blodkultur inneholder E. coli; B. forsterkning tomt av blodkultur inneholder S. aureus; Pseu ae, Pseudomonsom aeruginosa, uni, 16S universalsonden; Ecoli, Escherichia coli sonde; Pseu sp, Pseudomonas spp.. sonde, S. pneu, Streptococcus pneumoniae sonde, Strep sp, Streptococcus spp.. sonde, entero, Enterococcus spp.. sonde, S. aureus, Staphylococcus aureus sonde; Staph sp, Staphylococcus spp.. probe.
Figur 3. Amplification tomt på antibiotika resistenstesting av en E. coli isolat (utvalg 1). Hver kurve representerer en antibiotika at belastningen ble inkubert med. En tidlig signal er forårsaket av en høy bakteriell belastning, noe som betyr at belastningen har vokst i nærvær av den testede antibiotika og er dermed resistent mot antibiotika. Sene signaler tyder på at belastningen ikke har vokst i nærvær av antibiotika, med andre ord, det er utsatt.
| Eksempel 1: E. coli | Eksempel 2: S. aureus | ||||
| AST | Ct | R / S | AST | Ct | R / S |
| Amoksicillin 8 mg / L | 16,83 | R | Amoksicillin 0,25 mg / L | 21,03 | R |
| Amoxicillin-clavulanate 8/4 mg / L | 17,36 | R | Oxacillin 2 mg / L | 25,80 | S |
| Piperacillin 16 mg / L | 16,67 | R | Vankomycin 2 mg / L | 25,20 | S |
| Piperacillin-Tazobactam 16 /4 mg / L | 24,15 | S | Gentamicin 4 mg / L | 25,86 | S |
| Ciprofloksacin 1 mg / L | 29,72 | S | Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg / L | 24,62 | S |
| Ceftazidim 1 mg / L | 24,03 | S | |||
| Ceftazidim 8 mg / L | 26,58 | S | |||
| Gentamicin 4 mg / L | 29,83 | S | |||
| Trimetoprim-sulfametoksazol 2/38 mg / L | 27,60 | S | |||
| Negativ vekst kontroll (blanding av antibiotika) | 30,41 | Negativ vekst kontroll (prøve som er lagret ved 4 ° C) | 27,42 | ||
| Positiv vekst kontroll | 16,90 | Positiv vekst kontroll | 20,22 | ||
| Kutt-off Ct-verdi 1 * | 21,76 | Cut-off Ct-verdi 1 *** | 23,82 | ||
| Kutt-off Ct-verdi 2 ** | 18,75 | Cut-off Ct-verdi 2 **** | 22,02 | ||
| * For amoxicillin, amoxicillin-clavulanate, ciprofloksacin, gentamici, trimetoprim-sulfametoksazol ** For piperacillin, piperacillin-Tazobactam, ceftazidim | *** For vancomycin og gentamicin **** For amoxicillin, oxacillin og trimetoprim-sulfametoksazol |
Tabell 1. Bestemmelse av antibiotika resistenstesting av de to prøvene (E.coli og S.aureus). Ct-verdier på PCR-analysen ble kopiert til denne Excel-fil, som noe som kan automatisk beregner de to cut-off Ct alues fra den positive og negative vekst kontroll, ved hjelp av formlene vist i protokollen teksten. Hvis et antibiotikum viser en Ct verdi lavere enn cut-off Ct verdi, er belastningen motstandsdyktig mot antibiotika, hvis Ct verdien var høyere enn cut-off, er belastningen utsatt.
Discussion
Protokollen er beskrevet her muliggjør rask identifisering av patogener og gir en funksjonell antimikrobiell profil som kan føre til tidlig administrasjon av adekvate antibiotika og dermed bedre prognosen for pasienter med infeksjoner i blodbanen. Avhengig etterspurte forholdene i en test, dvs. lave kostnader, høy gjennomstrømning, minimal snu-around tid, kan testforhold justeres. Hele prosedyren kan utføres innen én virkedag. Videre kan de to delene av protokollen utføres samtidig, noe som reduserer turn-around tid betraktelig. Som presentert her, er identifikasjon panel et utvalg av de mest klinisk relevante bakterier i vårt sykehus. Siden den viktigste prinsippet er rettet mot 16S gen-regionen, kan spesifikke prober for andre mikroorganismer utformes og legges til analysen. Den komplette analysen ble opprinnelig ment for rask analyse av blodkulturer, men kan også brukes til behandling av other prøvemateriale. Dette er også tilfelle for de antibiotika som ble brukt for antibiotika resistenstesting: flere eller andre antibiotika kan legges til, basert på lokale motstand mønstre og retningslinjer.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Profileringsfonds Azm (PF245).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck Chemicals | 106404 | 0.9% in water |
| Vacutainer SST Serum Separator Tube 5 ml | BD Diagnostic Systems | 367986 | |
| Mueller Hinton II broth | BD Diagnostic Dystems | 212322 | 44 g/L in water |
| Centrifuge Rotixa 50 rs | Andreas Hettich GmbH Co. KG | 4910 | |
| Centrifuge 5415 D | Eppendorf | Discontinued | |
| Primers | Sigma-Aldrich | n.a. | |
| Probes | Sigma-Aldrich/Applied Biosystems | n.a. | |
| TaqManEnvironmental master mix 2.0 | Applied Biosystems | 4396838 | |
| iQ SYBRGreen Supermix | Bio-Rad Laboratories BV | 170-8880 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| iQ 96-Well PCR Plates | Bio-Rad Laboratories BV | 223-9441 | |
| Microseal B Adhesive Seals | Bio-Rad Laboratories BV | MSB-1001 | |
| Real-time PCR Detection System | Applied Biosystems | ABI PRISM 7900HT | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Laboratories BV | MyiQ Single-Color |
References
- Wallet, F. Preliminary clinical study using a multiplex real-time PCR test for the detection of bacterial and fungal DNA directly in blood. Clin. Microbiol. Infect. 16, 774 (2010).
- Beekmann, S. E., Diekema, D. J., Chapin, K. C., Doern, G. V. Effects of rapid detection of bloodstream infections on length of hospitalization and hospital charges. J. Clin. Microbiol. 41, 3119 (2003).
- Raymaekers, M., Bakkus, M., Boone, E., de Rijke, B., Housni, H. E. l, Descheemaeker, P., De Schouwer, P., Franke, S., Hillen, F., Nollet, F., Soetens, O., Vankeerberghen, A. Molecular Diagnostics working group. Reflections and proposals to assure quality in molecular diagnostics. Acta. Clin. Belg. 66, 33 (2011).
- Peters, R. P. New developments in the diagnosis of bloodstream infections. Lancet Infect. Dis. 4, 751 (2004).
- Hansen, W. L., Beuving, J., Bruggeman, C. A., Wolffs, P. F. Molecular probes for the diagnosis of clinically relevant bacterial infections in blood cultures. J. Clin. Microbiol. 48, 4432-4432 (2010).
- Beuving, J. Antibiotic susceptibility testing of grown blood cultures by combining culture and real-time polymerase chain reaction is rapid and effective. PLoS ONE. 6, (2011).
- Rolain, J. M., Mallet, M. N., Fournier, P. E., Raoult, D. Real-time PCR for universal antibiotic susceptibility testing. J. Antimicrob. Chemother. 54, 538 (2004).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad-range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257 (2002).
- Waites, K. B., Brookings, E. S., Moser, S. A., Zimmer, B. L. Direct susceptibility testing with positive BacT/Alert blood cultures by using MicroScan overnight and rapid panels. J. Clin. Microbiol. 36, 2052 ( ).
- Vliegen, I. Rapid identification of bacteria by real-time amplification and sequencing of the 16S rRNA gene. J. Microbiol. Meth. 66, 156 (2006).
- Hall, L., Doerr, K. A., Wohlfiel, S. L., Roberts, G. D. Evaluation of the MicroSeq system for identification of mycobacteria by 16S ribosomal DNA sequencing and its integration into a routine clinical mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 41, 1447 (2003).
