アイスキャップ：成長させる方法シロイヌナズナとトマト

Summary

アイスキャップの方法は1つがそれぞれの苗から96ウェルプレートおよび非破壊的収穫根の組織で植物を育てることができます。このルートの組織から抽出したDNAは、遺伝子型の反応に使用することができます。我々は、アイスキャップがうまく機能することを発見した

Abstract

それは植物の多数の遺伝子型を必要とするプロジェクトを開発するための植物科学者のために一般的になりつつある。あらゆるジェノタイピングプロジェクトの最初のステップは、個々の植物から組織サンプルを収集することです。このタスクの伝統的なアプローチは、一度に1台ずつの植物をサンプリングすることです。個人の遺伝子型の数百または数千に1つの願いは、しかし、タイピングパイプラインの重要なボトルネックで、この戦略の結果を使用している場合。ここでは説明しているアイスキャップ法は、ある科学者が一日の^1,2で数千本の苗木から組織を収集できるようにすることで、この課題へのハイスループットなソリューションを提供します。スループットのこのレベルは、組織はむしろ、一度に1台ずつではなく、96枚ごとの植物から収穫されているという事実によって実現されています。

アイスキャップ方式では、苗の成長、組織の収穫、およびDNAの抽出を行うための統合プラットフォームを提供します。アイスキャップのための基礎はseedliの成長です。96ウェルプレートの積層ペアのNGS。アッパープレートのウェルは、個々の苗が発芽する寒天の増殖培地のプラグが含まれています。ルーツは、寒天培地を下に成長する穴に通し、上部プレートを終了し、水を含む下側プレートに渡します。アッパープレートの苗は、室温でままDNA抽出のために組織を回収するために、ルートの組織を含む下側プレート内の水が急速に凍結されています。アッパープレートを氷と96実行可能な苗とワンプレートで凍結96ルートの組織サンプルを一つのプレートをもたらして、離れて下側プレートから剥離される。それがルートの組織をキャプチャするために氷を使用​​するための手法は、"アイスキャップ"という名前です。苗を含む96ウェルプレートは、ホイルで包み、低温に転送できます。このプロセスは、苗のさらなる成長を中断しますが、彼らの生存率には影響しません。遺伝子型の解析が完了したら、目的の遺伝子型を持つ苗木を96ウェルpから転送することができますさらなる伝播のための土壌に遅れて。我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米の苗を使ってアイスキャップ方式の有用性を実証している。我々は、メソッドはまた、96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ植物の他の種にも適用する必要があることを期待しています。

Protocol

1。寒天の増殖培地でアイスキャップの苗のプレートを準備

溶融成長培地（0.5Xムラシゲとスクーグ（MS）基底塩の混合物、2mMのMorpholinoethanesulfonic酸（MES）、0.6％の寒天（w / v）の、pHは5.7）MicroFillのマイクロディスペンサーを用いてオートクレーブ苗プレートに分注しています。メディアの1リットルは、18苗のプレートごとに必要とされる。

1. スクリュー上部蓋と20分間オ​​ートクレーブで1リットルのガラスボトルで増殖培地を準備。
2. オートクレーブネジ上部蓋付きガラス瓶に蒸留水1リットル。同時にまた、アルミ箔に包まれた空の苗のプレートをオートクレーブ。
3. 65℃インキュベーターにセットしてオートクレーブ滅菌媒体と水を移し℃にこの温度は、溶融状態での増殖培地を維持します。
4. オートクレーブ後、乾燥するために層流フードで箔と場所から苗木のプレートを取り外します。プレートには接着剤の梱包テープができるように、先に進む前に、完全に乾燥している必要があります完全にプレートのウェルの底の穴をシール。
5. 無害化するために95％エタノールで実験室のベンチを拭う。
6. 無害化するために95％エタノールで実生板の透明なプラスチック製の蓋を浸す。エタノールおよび層流フードの乾燥空気から蓋を取り外します。彼らはオートクレーブ中で溶けてしまうので、それらを滅菌するためにプラスチック製のふたをオートクレーブしないでください。
7. それぞれの苗のプレートの底部にパッキンテープを適用し、しっかりとローラーのツールを使用してシールします。
8. 65℃に設定した水浴中に溶融増殖培地、滅菌水のボトルを置きます
9. MicroFillのマシンに、室温で70％エタノールの入ったボトルを取り付け、2回がMicroFill機の配管を無害化するためにパージサイクルを実行します。
10. MicroFillマシンに滅菌水でボトルを取り付けます。 6回は、配管を温め、システムからエタノールをクリアするためにパージサイクルを実行します。水のボトルは、この手順全体を通して65℃の浴に残るはず。
11. 滅菌水でパージを完了した後、直ちにMicroFillマシンに溶融増殖培地のボトルを取り付けます。配管のうち、蒸留水をクリアするには、パージサイクルを2回実行します。増殖培地のボトルは、この手順全体を通して65℃の浴に残るはず。
12. それぞれの苗のプレートのウェルに増殖培地450マイクロリットルを分注する。増殖培地はMicroFill機の配管で固化しないようにすぐに働く。
13. 苗のプレートのすべてが満たされた場合は、直ちにMicroFillのマシンに65℃の滅菌水ボトルを接続し、パージサイクルの配管をきれいに12回実行する。水のボトルは、この手順全体を通して65℃の浴に残るはず。
14. MicroFillマシンが使用できない場合は、苗のプレートは、マルチチャンネルピペッターを用いて密封されたプレートに手ピペッティング溶融寒天によって調製することができる。
15. それぞれの苗のプレートtの井戸を検査Oは、増殖培地は、任意の井戸から流出していないことを確認してください。必要に応じて、個々のウェルに手ピペット追加の溶融増殖培地を。
16. 透明なプラスチックのふたで各プレートをカバーし、増殖培地は室温で苗木のプレートに固化することができます。スタックプレートと4℃貯蔵のためのアルミホイルでラップ℃に貯蔵中に井戸で水の蓄積を防ぐために上下逆さまにプレートを保管してください。

2。アイスキャップの苗木のプレートと発芽苗に種をまく

我々は以前にシードローディング装置（2）を使用して苗のプレートにシロイヌナズナの種子を分配するための半自動化された方法を記載している。このデバイスは、種子の一部のバッチのために有用であるが、我々は、 シロイヌナズナの種子の異なるバッチで表示される種子の大きさにばらつきがこのデバイスの一般的なユーティリティを制限することを見出した。私たちは、BU、シード調剤の代替自動化された方法を開発中です現時点で我々は、苗のプレートに種子を分配するための最も効果的な戦略は以下のように手でこの手順を実行することをtを​​発見した。

1. ワットマン濾紙の上に乾燥種子を振りかける。
2. 種子の全てがエタノールで覆われるように、種子に95％エタノールを分注する。この治療法は、表面の種子を滅菌します。
3. 種子が風乾する。
4. 修正された使い捨てのガラスパスツールピペットを用いて苗のプレートのウェルに個々の種子を譲渡する。パスツールピペットの終わりは、先端を炎で密封される。得られたガラスの先端を穏やかに、単一の種子は簡単にピックアップし、苗のプレートのウェル内で寒天の表面に転送できるようにする寒天培地、に触れることで湿らせて。この種のメッキツールのダブルヘッドのバージョンは、スループットを向上させることができます。
5. 細孔サージカルテープで透明なプラスチックの蓋とシールで、各苗のプレートをカバーしています。スタックプレートをラップ4のアルミ箔とストアのシロイヌナズナの種子を° Cは、4日間の種子を層別し、発芽を同期する。トマトの種子は4日間12℃の暗所で保管してください。
6. 18 °〜20 ° C発芽を開始することで蛍光灯の下で苗のプレートを置きます。

3。アイスキャップの泉へ苗木のプレートを転送する

苗のプレートは、4日間の光の下でされた後、アイスキャップの噴水に苗木のプレートを転送する。 シロイヌナズナの場合、苗は通常10〜14日間アイスキャップの噴水に残されます。

1. プラスチック製の収納ボックス内に置かれていますカスタムラックの構造の上にクッキーシートを配置することにより、アイスキャップの泉を組み立てます。クッキーシートのレベルを調整するレベリングのナットを使用してください。ストレージボックス内の水中ポンプを置き、バネCLAを使用してポンプからクッキーシートの側に出力ホースを取り付ける融点。アイスキャップの泉の表面が直接蛍光灯を受け取るように、植物の成長室や成長室内の棚の上にアイスキャップの泉を組み立てます。
2. 3部1部の水道水に蒸留水の混合物とアイスキャップの泉を埋める。水中ポンプは水位下数センチになるまで水を噴水に追加する必要があります。ラボのテープを使用してプラスチック製の収納ボックスで、最終的な水位とマーキングペンをマーク。
3. ルートのプレートの各ウェル一つ3/32-inch直径のステンレススチール製のボールを追加することにより、ルートのプレートを準備します。
4. ステンレス鋼球は、特注のボール分配装置^1を使用してルートをプレートに添加することができます。このデバイスは、96ウェルPCRプレートの表面上にアルミ箔の単一のシートを置き、箔の表面に各ウェルの中心の位置をマークするマーキングペンを用いて行われる。箔のこのマークシートはその後のために、アルミニウムの追加の6枚の上に配置されますILと使用されるピペットチップボックスから蓋の滑らかな表面を包んだ。このような木製の串のようなシャープツールは、96の位置のそれぞれにおいて、単一の金属のボールを保持するのに十分な大きさディボットを作成するために使用されます。ボールを持つこのディスペンス装置を埋めるために、金属球の過剰は、デバイスの上に注がれ、それを穏やかに過剰ボールを除去するために振とうする。ルートのプレートは、ルートのプレートの各ウェルに1つのボールをドロップするように裏返している分配装置、の上に配置されます。
5. MicroFillのマシンを使ってルートのプレートの各ウェルに1部の水道水に3部蒸留水の混合物の340マイクロリットルを追加。鋼球が水を分配する前に、ルートのプレートに追加されていることを確認してください。
6. 苗のプレートの底面から粘着フィルムをはがし、プレートから透明なプラスチック製の蓋を取り外します。金属球と水を含むルートのプレートに各苗のプレートを置き、2つの弾性ハイフォンを使用して2つのプレートを固定Rバンド。
7. アイスキャップの泉に積み上げアイスキャッププレートを置きます。プレートはアイスキャップの泉にいるときに透明なプラスチック製のふたは使用しないでください。よく苗プレートの- 01は、ルートのプレートのウェル- 01と揃っていることを確認してください。
8. 苗の大部分は、ルートのプレートに浸透しているルートの組織を持つまで積み上げ苗/ルートプレートはアイスキャップの泉ままにしておく必要があります。アイスキャップの泉でのシロイヌナズナ実生のための理想的な成長温度は約です。 18℃クッキーシート内の水位は苗のプレートの苗が水没しているように深いように水がルートのプレートのウェルに流れることができるかもしれないが、ではないはず。水位が正しくない場合は、正しい深さの異なるクッキーシートを取得する必要があります。
9. オリジナルの水位を維持するためにアイスキャップの泉へ定期的に蒸留水を追加。噴水に純粋な蒸留水を加えることで、置き換えられます液体は、噴水の水の鉱物組成を変更することなく蒸発のために失わ。水位はアイスキャップの泉で毎日チェックする必要があります。

4。収穫根の組織

ルートの組織は、ルートのプレートに水を凍結し、ルートのプレートから離れて苗板を剥離することによって収穫される。

1. 日根の組織を採取する前に、アイスキャップの泉から積み上げアイスキャップのプレートを取り外します。
2. 積み重ねられた苗や根のプレートのウェル間には三木製の串を挿入します。串の目的は、凍結プロセスの準備のためにルートのプレートのウェルの苗のプレートのペン先を高めることです。
3. ライトの下で一晩放置して挿入した木製の串を積み重ねアイスキャッププレートを許可する。このインキュベーションは、その後の凍結とプレートの分離プロセスを容易にルートプレート、中の液体のわずかな蒸発が可能になります。
4. の組織の収穫の日、凍結風呂の準備をする。ドライアイスと95％エタノールの混合物とパイレックスの皿に96ウェル金属熱ブロックを置きます。サーマルブロックは、CAの温度で平衡させる。 20分。このような低温は、実験台の表面を損傷しないようにミトンオートクレーブとして絶縁材料のいくつかのタイプの上にパイレックスの皿を置きます。
5. 5分間冷却した熱ブロックとインキュベートに木製の串を積み重ねアイスキャッププレートを置きます。この時間の間にルートのプレート内の水が固体フリーズします。苗のプレートの苗は、この治療中にフリーズすると完全に実行可能なままにしないでください。
6. サーマルブロックからスタックアイスキャッププレートを外し、室温で実験台の上に置きます。弾性バンドと積み上げ板から木の串を削除します。しっかりとプレートを"クラック"するために苗のプレートの上部を押し下げます。その後、慎重にルートのプレートと苗木のプレートAPピール芸術。
7. ルートのプレートの水は室温で解凍することができます。融解は25℃に設定サーマルブロック℃でルートのプレートをインキュベートすることにより、迅速できます

5。ダークで低温で苗のプレートを保存する

組織の収穫に続いて、苗のプレートは、遺伝子型の解析が実行されている間苗の生存を維持する低温で暗所に保存することができます。苗は生存率に影響を与えることなく、数週間のために、これらの温度で保存することができます。

1. 組織の収穫に続いて、粘着テープで苗のプレートの下の部分をシールします。
2. 苗のプレートの上に透明なプラスチックの蓋を置き、孔テープで固定します。
3. 一緒にいくつかの苗のプレートをスタックし、アルミ箔で包んでください。
4. シロイヌナズナ実生の場合は、4℃でプレートを置く℃にトマト苗の場合は、12℃でプレートを配置一度タイピングでは、SE完了ですedlingsは、この低温のインキュベーションから削除し、下記のように土壌に移植することができる。

6。 DNA抽出

PCR反応に適したDNAを容易にルートの組織サンプルから抽出することができます。 シロイヌナズナの根の組織サンプルから回収した全DNAの収量は約です。平均² 400ngの。

1. ルートのプレートに水が完全にDNAの抽出の手順を実行する前に融解していることを確認してください。いずれかの井戸が平均より大幅に少ない水を持っているかどうかを判断するためにプレートを点検してください。追加の水を必要とする井戸に手ピペット蒸留水を。
2. ルートのプレートの各ウェルに、トリス- EDTA溶液（50mMのEDTA、PH8 500mMのトリス、pH 8）の25マイクロリットルを追加するMicroFillのマシンを使用してください。
3. サーマルシーリング箔とヒートシール機を用いてルートのプレートのウェルを密閉する。
4. とGenoGrinderマシンで密封されたルートのプレートを置きます下向きにしてプレートの密封終わり。このプレートの向きは、最適なビーズの動きを提供し、井戸に付着ビーズを防ぎます。毎分1350ストロークで3 ½の分GenoGrinderでプレートを振る。
5. マイクロプレートキャリアと遠心プレートを移し、4℃で3500rpmで10分間プレートを回転させ° Cをペレットに粉砕根組織。
6. 結果として得られる希釈抽出は、直接PCR反応に使用できるゲノムDNAが含まれています。通常1つは、PCR反応には、このDNA抽出液の2マイクロリットルを追加します。
7. DNAサンプルの保管のため、マイナス20で接着梱包テープと場所を使用してマイクロプレートをシール℃にDNAサンプルは、品質に明らかな減少で数ヶ月保存できます。

7。土壌に望ましい遺伝子型を持つ苗木を転送する

遺伝子型の解析が完了すると、目的の遺伝子型を持つ苗木は苗木から転送することができます土壌へのプレート。

1. コー​​ルドストレージから苗のプレートを取り外し、水飽和土壌の混合物とポットを用意。
2. 苗のプレートから個々の苗を削除するには、一苗を破砕することなく寒天プラグをつかむことができる鉗子を使用してください。鉗子で寒天プラグをつかんで、ゆっくりと苗を傷つけないように注意しながら苗のプレートのうち寒天プラグをスライドさせます。また、加圧された空気が静かに寒天のプラグと同様の苗外を撮影するために使用することができます。プラグは、実験台の上に飛び出して外れるまで、井戸の底の小さな穴に圧力を適用する。
3. 土壌寒天プラグの大きさで小さな穴を準備します。土壌に寒天プラグを取り付けて、土壌中の苗を確保するために寒天のプラグ周りの湿った土を詰める。苗の周りから寒天のいずれかを削除しようとしないでください。
4. 標準成長条件下で成長室内の移植苗を置きます。のためのプラスチック製の蓋付き鍋をカバー移植後の最初の二日間。その後蓋を外すと、標準条件を用いて植物を成長を続けている。

8。代表的な結果：

アイスキャップのシステムを用いて成長シロイヌナズナ実生の例を図4Aに示されています。これらの苗は、写真が撮られた時に二週間アイスキャップの噴水になって、組織の収穫の準備ができていたていた。これらの同じ苗から根の組織を図4Bに示されています。 シロイヌナズナの根の組織の一つのサンプルから抽出したDNAの総量は、700 ngの²から100 ngの範囲で、典型的です。この利回りの計算は、原油の根のエキスの一部分の使用に基づいています。のでCAだけ。原油根エキスの10％は、通常、DNAの抽出プロセスに使用される、それは粗抽出物の多くを保持することにより、下流の分析のためにかなり多くのゲノムDNAを得ることができる。アイスを使用して得られたゲノムDNAの合計量キャップの手順は、PCR反応²の数百を実行するのに十分です。

図1：アイスキャップのプロセスのフローチャート。苗は発芽する寒天の成長培地を含有するA）苗プレート。ルーツは、寒天を貫通し、プレートの底に向かって伸びる。プレートのウェルの底の穴は、接着フィルムで密閉されています。 B）苗のプレートは、水と金属球を含むルートのプレートの上に積み重ねている。ルーツは、苗のプレートのウェルの底に穴を終了し、ルートのプレートのウェルに成長する。 C）木製串は、積み重ねアイスキャップのプレートはドライアイス/エタノール浴中のサーモブロックに配置されている日を前に苗のプレートとルートのプレートの間に挿入されています。ルートのプレートに水が固体凍結されるとD）、苗のプレートは、96組織サンプルでルートプレートをもたらして、ルートのプレートから剥離され96実行可能な苗とし、苗のプレート。木製の串は、このステップの間に2つのプレートの分離を促進する。

図2：苗プレートとルートのプレートの写真。 A）苗のプレートと別に見られるルートのプレート。 B）苗のプレートには、ルートのプレートの上に積み重ね。 DNA抽出に使用する鋼球は、ルートのプレートのウェル中に見ることができます。ゴムバンドは2つのプレートを保護するために使用されます。

図3：アイスキャップの泉。アイスキャップの泉は、ルートのプレートのウェルの頂部の正確な高さで一定の水位を維持するために使用されます。この連続的な給水システムは、ルートのプレートのウェル内の水が蒸発や蒸散による枯渇しないようにします。 A）自家製のラックそれは、スタックアイスキャッププレートが座っているクッキーシートをサポートしています。 B）正確に均一な水の深さが噴水の表面を横切って達成されるようにクッキーシートのレベルを調整するための手段を提供する1"ナットの1つのクローズアップビューを。C）この画像は、のすべてが表示されます。部品は、アイスキャップの泉。D）組み立てアイスキャップの泉のホームメイドのラックを構築する必要がありました。水中噴水ポンプは絶えず下池から自家製の上にかかってクッキーシートに水を移動ラック。バネクランプは、クッキーシートの端にホースを接続するために使用されます。

図4：アイスキャップのプロセスを用いて成長シロイヌナズナ実生。 A）トップビューには、苗のプレートの2つのウェルに見下ろして。各ウェルには、 シロイヌナズナ実生が含まれています。ルートのプレートの2つのウェルのB）は側面図。ルーツは、ツイスト見ることができます。井戸の内面の周り。この写真の苗は、CAのためにアイスキャップの泉にされていた。二週間と組織の収穫が正常に行われる成長段階にある。

Discussion

ここで紹介するアイスキャップ法は一日で、個々の植物の数百、または数千、から組織サンプルを収集し、効率的にタイピング反応で使用するために、これらのサンプルからゲノムDNAを抽出するためにある科学者が可能になります。個々の科学者を短期間で苗木の遺伝子型の数千に能力を与えることによって、アイスキャップ方式では、そうでない場合は実行するために実用的ではないと遺伝学的実験の数を容易にする可能性を秘めています。いくつかの例を以下に用意されています。

1. 遺伝的マッピング 。研究者は、第³染色体に沿って指定された時間内で組換えイベントを識別することができる場合ファインスケールの遺伝子マッピングが速くすることができます。この間隔が非常に短い遺伝的距離が含まれている場合は、その後の組換え現象は​​分離マッピング集団では比較的まれである。このような理由から、それは希望の再を見つけるために、個々の植物の数千をスクリーニングする必要がありますcombinant個人。このプロセスは、アイスキャップの使用により大幅に促進された可能性があります。であってもゲノムワイドな再シーケンシングの時代に、それが直接、特定の変異は、関心の表現型の直接の原因であることを実証するために依然として必要です。これらのケースでは、候補となる変異が実際に原因であることを証明するために、他の密接にリンクされている変異から離れて興味の変異を分離することが必要となります。このような状況では、アイスキャップはしっかりとリンクされている変異のペア間の結合を壊すための効率的な方法を提供するであろう。
2. マルチ変異体 。それは、機能的な冗長性^4-6を克服するために、単一の個体に複数の別個の遺伝子座から突然変異対立遺伝子を結合するためにシロイヌナズナを研究する研究者のために一般的になっています。例として、1つは遺伝的交雑を介して単一の植物に4つの異なった遺伝子座から突然変異対立遺伝子を結合した​​い場合を考えます。このプロジェクトでは、それが生成するために必要となる交差スキームの一部として、これらの4つの遺伝子座でヘテロ接合体であるn個の個々の。この四重ヘテロ接合体セットの種子は、四重ホモ接合体は子孫の結果として人口の256人に1人の割合で存在することが期待されているときに。伝統的な方法でこの珍しい個々のスクリーニングはかなりの手間になる。比較することにより、このプロジェクトのためにアイスキャップを使用すると、単一の世代に珍しい四重ホモ接合体を識別するための効率的な戦略と科学者を提供するでしょう。
3. iTILLING。当研究室では最近、 シロイヌナズナ ⁷で目的の遺伝子の誘発突然変異の存在をスクリーニングするための新しいアプローチを説明した。このメソッドは、化学変異原^80〜10で治療した患者の順序付けられた集団での変異を見つけるために使用されている耕起と呼ばれる確立された技術のバリエーションです。それがIND許可ティラーの個別バージョンであるため、我々はiTILLINGたちという名前のメソッドにしている伝統的に大規模な研究チームが完了するために必要としていますが何かを達成するためにividual科学者。後述するように氷のキャップは、iTILLING方法⁷の不可欠な部分を形成している。

iTILLINGの背後にある考え方は、伝統的な耕作のプロジェクト用に作成された耐久性のある変異体の集団とは対照的に立っている一時的な変異個体を、生成することです。 iTILLINGの場合は、筋肉隆々 M2集団から種子は、50から100アイスキャップのブロックに播種し、そしてDNAはアイスキャップ法を用いて抽出されます。 シロイヌナズナ実生は、4に配置されている° C変異のスクリーニングは、アイスキャップのDNAを使用して実行している間プレップ。トマトの苗を12℃で保存されます。苗運搬所望の変異が特定されたら、彼らはアイスキャッププレートから回収し、土壌に転送されます。 iTILLINGは、画面全体の研究コミュニティのための長期的な変異体集団を提供することを意図されていません。その代わり、iTILLINGはどのによって戦略を提供します。ある科学者は、効率的、かつ比較的低コストで、迅速に遺伝子の一握りの突然変異のためのカスタム変異個体を選別できます。

我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米を栽培し、ジェノタイピングのための効果的な方法であることがアイスキャップを発見した。我々は、植物の他の種がまたアイスキャップに従順であることを期待しています。アイスキャップに収容することができる、様々な種の1つの制限は、種子の大きさです。 96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ唯一の植物は、その現在の構成でアイスキャップと互換性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GenoGrinder	Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ	2000 Geno/Grinder	Machine for shaking Root Plates for DNA extraction
ABgene Thermo-Sealer	ABgene Limited	AB-0384	Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption
Centrifuge equipped with swinging microplate carriers	Beckman Coulter Inc.	Allegra 25R	Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable
MicroFill Microplate Dispenser	BioTek	AF1000A	Automated liquid dispenser for filling microplates
Bialetti brand 17x11 inch Commercial Large Cookie Sheet	Target Department Store	www.bialetti.com	This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap
Custom Made Metal Rack	Hardware Store		See text for full description
33 Liter plastic storage box	Target Department Store	Sterilite Brand	For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17x11 inch cookie sheet
30 gallon per hour Fountain Pump	Sunterra	104506	Small submersible fountain pump available at garden supply stores
Hose for fountain pump	Any Supplier		Hose compatible with fountain pump
Plastic Clamp	Hardware Store		Clamp to hold hose to cookie sheet
Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates	BD Biosciences	351172	Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates
3M Micropore surgical tape	Fisher Scientific	19-027-761
3/32-inch diameter stainless steel balls	Hartford Technologies, Rocky Hill, CT	034-006-1K	Used to disrupt root tissue after harvest
3 inch Elastic hair bands	Local Grocery Store		Used to secure Root Plate to Seedling Plate
4 mm diameter wooden skewers	Local Grocery Store		These skewers are typically used to prepare kabobs
Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit	Fisher Scientific	278012	96-well Seedling Plates with holes in bottom.
Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate	Fisher Scientific	14-230-242	96-well Root Plates
Agar - cell culture tested	Sigma-Aldrich	A1296
4-Morpholin–thanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M2933
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Sigma-Aldrich	M-5524
Easy Peel heat sealing foil	ABgene Limited	AB-0745	Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption
Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00" x 54.6 yd	Office Max	Item no. 21242139	Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage
Sealing Roller	Bio-Rad	MSR-0001	Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates
96-well metal thermal block	Cole-Parmer	36400-66	Used to freeze the Root Plates for tissue harvest
Whatman Filter paper	Whatman, GE Healthcare	1002 090	Used for surface sterilizing seeds
Disposable Pasteur Pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	5 ¾"disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate
Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm)	Target Department Store		Used to construct a dry ice/ethanol bath.