Summary
Um dispositivo de microfluidos para a investigação de compartimentalizar cancro migração de células estaminais é descrito. Esta plataforma inovadora cria um microambiente viável celular e permite a visualização microscópica de locomoção de células vivas. Altamente móveis células cancerosas são isolados para estudar os mecanismos moleculares de infiltração agressiva, levando potencialmente a terapias mais eficazes no futuro.
Abstract
Nos últimos 40 anos, os Estados Unidos investiram mais de 200 bilhões de dólares em pesquisa de câncer, resultando em apenas uma redução de 5% na taxa de mortalidade. Um dos principais obstáculos para melhorar os resultados dos pacientes é a má compreensão dos mecanismos subjacentes à migração celular associada com metástase invasão agressiva de células de câncer, e resistência à terapêutica 1. Glioblastoma multiforme (GBM), o mais prevalente tumor cerebral maligno primário adulto 2, exemplifica esta dificuldade. Apesar padrão cirurgia, radiação e quimioterapia, a sobrevida média do paciente é de apenas 15 meses, devido à infiltração GBM agressivo no cérebro adjacente e recorrência do câncer rápida 2. As interações de mecanismos celulares aberrantes migratórias e do microambiente tumoral provável diferenciar o câncer das células normais 3. Assim, a melhoria de abordagens terapêuticas para GBM exigir uma melhor compreensão dos mecanismos de migração de células de cancro. Trabalhos recentes sugerem thata pequena subpopulação de células dentro de GBM, do cérebro de células-tronco do tumor (BTSC), podem ser responsáveis pela resistência à terapêutica e de recorrência. Mecanismos subjacentes capacidade migratória BTSC estão apenas começando a ser 1,4 caracterizados.
Devido a uma limitação na inspecção visual e a manipulação geométrica, os ensaios de migração convencionais 5 estão restritos a quantificar as populações de células totais. Em contraste, dispositivos microfluídicos permitir uma análise única célula por causa da compatibilidade com microscopia moderna e controle sobre micro-ambiente 6-9.
Nós apresentamos um método para caracterização detalhada de BTSC migração usando compartimentar dispositivos microfluídicos. Estes dispositivos PDMS-feitas lançar o meio de cultura de tecidos em três compartimentos conectados: semeando câmara, câmara receptora e ponte microcanais. Nós adaptado o dispositivo de tal forma que ambas as câmaras segurar meios suficientes para apoiar BTSC viável para 4-5 days sem troca de mídia. BTSCs altamente móveis inicialmente introduzidos na câmara de sementeira são isolados após a migração embora bridging microcanais para a câmara de recepção paralela. Esta migração simula a propagação do cancro celular através dos espaços intersticiais do cérebro. As imagens de fase ao vivo da morfologia celular durante a migração são registrados durante vários dias. BTSC altamente migratório pode, portanto, ser isolado, recultivadas, e analisadas mais.
Microfluídica compartimentar pode ser uma plataforma versátil para estudar o comportamento migratório de BTSCs e outras células-tronco cancerosas. Através da combinação de geradores de gradiente, manuseamento de fluido, micro-eléctrodos e de outros módulos microfluidicos, estes dispositivos podem também ser utilizados para o rastreio de drogas e diagnóstico da doença 6. Isolamento de uma subpopulação de células migratórias agressivo permitirão estudos de mecanismos moleculares subjacentes.
Protocol
1. BTSC célula de dissociação
BTSCs são derivadas de pré-existentes culturas são crescidas em meio isento de soro de células estaminais como neuroesferas. cultura da qual é previamente descrito 10, 11.
- Preparar a suspensão de células a partir de derivados de BTSC neuroesferas. BTSC derivados neuroesferas são recolhidas num tubo de 15 ml e centrifugado a 900 rpm durante 5 minutos. Faster centrifugação lata de cisalhamento e / ou danificar as neuroesferas. O sobrenadante é aspirado e a cultura neuroesfera é ressuspenso em 0,5 ml de pré-aquecido Accutase. Esta solução é incubada durante 5-10 minutos a 37 ° C permitindo que os neuroesferas a afrouxar. As células são mecanicamente interrompidos com 10-20 movimentos suaves de uma pipeta P100 e depois 1,5 ml de meio de células estaminais é adicionado às células de neutralizar a Accutase.
- Os BTSCs são então centrifugadas a 1300 rpm durante 5 minutos, e ressuspensas em 1 ml de meio de células estaminais.
- Uma alíquota de 50 ul foi removida dos suspension e colocado dentro de um tubo de microcentrífuga para contagem das células. 50 ul de azul de tripano é adicionado ao tubo de Eppendorf e a suspensão é colocada num hemocitómetro para contagem das células.
- Se necessário, após a contagem das células, o meio de células estaminais adicionais é adicionada à suspensão BTSC para dar uma densidade celular de 20000 células vivas / media ul.
2. Fabricação de bi-camadas su-8 mestre e moldagem de selo PDMS (ver figura 1)
Usamos litografia óptica e de litografia suave para fabricar su-8 mestre e PDMS selo, que são essenciais para a montagem dos dispositivos microfluidicos. Ligeiramente diferente do que o processo normal de 12, a su-8 mestre é composto de duas camadas. Os microcanais 3 mícrons de altura são fundidos em que a primeira camada / inferior mais cedo no processo, enquanto as câmaras de 250 mícrons de altura de semeadura e recepção estão na segunda camada / superior. Para que a conexão correta entre dois compartimentos de cultura (microcanaiss e câmaras), as duas camadas têm de ser alinhados com precisão na sua posição. No entanto, a espessura e opacidade da segunda camada são suficientemente grandes para bloquear o alinhador fiducial / óptica de aceder aos recursos de fundo. Aqui nós desenhar as máscaras com marcadores fiduciais sendo posicionado remotamente. Assim, esses marcadores na primeira camada pode ser selectivamente protegidos durante a rotação da segunda camada. Como resultado, ambas as camadas de recursos são feitas em um mestre e pronto para a moldagem em baixo-relevo do carimbo PDMS.
- Projetar e preparar dois foto-máscaras. Uma máscara é constituída por dois marcadores fiduciais e uma matriz de microcanais (400 m de comprimento e 10-50 uM de largura) para a primeira camada. Outra máscara consiste em semear e receber as câmaras (2 mm de comprimento e 600 um de largura), para a segunda camada. Ambas as máscaras são concebidos em Illustrator (Adobe, Califórnia), laser-impresso em filmes transparentes (peças de metal finas, Colorado), lavadas com isopropanol e seco ao ar.
- Fazer com que a primeira camadasu-8 fotorresiste (Microchem, Massachusetts), de acordo com o manual do produto do fornecedor. Primeiro, spin-revestimento da pastilha pega (Materiais WRS, Califórnia) com 3-um de espessura fotorresistência de su-8 (5), seguido por mole de cozimento. O fotorresiste é então ultravioleta-exposta e curada com a máscara correspondente em contacto de perto, seguido de pós-cozimento e em desenvolvimento.
- Spin-revestimento da segunda camada de 250 um de espessura, com su-8 (2100). A fim de evitar fotorresiste espesso de bloquear os marcadores fiduciais da primeira camada, que cobrem estas áreas com fita adesiva em rotação antes do revestimento da segunda camada. A fita é então arrancada para revelar os marcadores para fins de alinhamento.
- UV-expor a segunda camada com a segunda máscara. Com os marcadores de alinhamento revelado, é muito simples para alinhá-los para os da segunda máscara usando alinhador de máscara óptica. A segunda camada de material fotosensitivo é então exposta e ultravioleta curado em contacto próximo, seguida de pós-cozedura e em desenvolvimento. </ Li>
- Anti-stick revestimento do mestre resultou. Para ajudar na remoção de PDMS curado, o su-8 mestra pode ser silanizada via deposição de vapor para fazer a superfície de um revestimento antiaderente tipo. Basta colocá-lo num exsicador durante pelo menos uma hora, com várias gotas de tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctilo) solução de silano, sob vácuo.
- Moldar PDMS com o mestre. Misturar base de pré-polímero de PDMS e curador de Sylgard 184 (Dow Corning, Michigan) em 10:1 completamente. Colocá-lo num exsicador para desgaseificação a vácuo até nenhuma bolha de ar é vista. Despeje a mistura sobre a máscara e desgaseificar novamente se bolha de ar novo é introduzido. Curar o molde numa placa de aquecimento para o nível de 2 horas a 90 C. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, gentilmente liberar o selo PDMS. Assim, a cultura de canais são gravados em PDMS e pronto para a montagem do dispositivo. O mestre é reutilizável para a moldagem até que esteja rachado ou desgastado. O revestimento anti-aderente tem de ser executado novamente quando a viscosidade retoma.
3.Conjunto de dispositivos microfluidicos e cultura de células (Figura 2)
A fim de células de cultura, característica-gravado selo PDMS está ligado a uma lamela de vidro para formar canais fechados. Entradas e saídas são criados para carregar a cultura / media. Por outro lado, a limpeza e outros procedimentos para o substrato de vidro e carimbo PDMS são necessários para assegurar a compatibilidade celular.
- Fazer reservatórios através do selo PDMS usando biópsia furador. Nós escolher o seu diâmetro ser de 6 mm. Estes reservatórios servem para duas finalidades. Um é para conter nutrientes extra para o crescimento celular. A outra é para o acesso de pipetas de carregamento e de aspiração a vácuo.
- Embeber o selo PDMS em 70% de etanol durante 30 minutos e, em seguida, lavado com água desionizada para mais 10 min. O objectivo é eliminar potenciais resíduos orgânicos introduzidos durante o processo de fabrico, e não reticulado contaminação PDMS. Mais intensas e completa processos de limpeza, tais como extração orgânica 13 14 foram usados em outra parte. No entanto, achamos desnecessário na cultura BTSC.
- Esteriliza-se o carimbo de PDMS usando autoclave (121 ° C, 35 min). Este passo completa a reacção de reticulação de PDMS. A partir deste passo, e até que o passo 3.6, todos os procedimentos são tomadas de uma forma estéril.
- O carimbo de PDMS é então colocada sobre uma lamela de vidro, que é previamente revestidas com poli-L-lisina. 15-17 O dispositivo é então revestida com laminina, enchendo o canal com laminina solução durante a noite a 37 ° C. A laminina é aspirado a partir do dispositivo e o dispositivo é lavado com o meio de células estaminais.
- Carregar suspensão de células a partir do passo 1 em reservatórios e canais. 11 ul de células dissociadas são colocados em um reservatório de semeadura. A aspiração a vácuo é utilizada para forçar as células dentro da câmara de propagação, se necessário. Um adicional de 7 uL de células são colocadas no reservatório de semeadura adjacente. Nota: densidade celular média é de 20.000 células / uL mídia. À réer cinco minutos, a semeadura e reservatórios que recebem são inundadas com a mídia.
- Coloque um 0,5-1 mm pré-autoclavadas folha PDMS no topo. A adesão superficial ocorreu naturalmente entre dois pedaços de PDMS vai fazer a cultura de células selado e pronto para a incubação de transporte, e de imagem microscópica.
4. De longo prazo de imagem time-lapse de BTSC migração com BioStation IM (Nikon Instruments Inc, Melville, EUA).
Combinando câmara, software e incubadora numa só embalagem, este sistema microscópico permite a cultura de células de imagem sem perturbação durante dias. Além disso, o seu design único motor move a lente objetiva e mantém fase estacionária na amostra o recurso de ponto-visita. Isto torna mais prática a experiências de imagem paralelas e locomoção celular em faixa de alto rendimento do ensaio.
- Pré-equilibrar a IM Biostation durante 45 minutos para estabilizar o fornecimento de humidade, temperatura e ar. Além de vários água cont-pratos ained na câmara de amostragem é utilizado para manter a humidade adequada.
- Carregar o dispositivo célula-suficiente na câmara de amostra de microscópio, e centralizá-lo, usando uma pinça micro.
- Ajuste o foco, a posição de pontos e tempo-pontos em software Biostation e iniciar o lapso de tempo.
5. Os resultados representativos:
Exemplos de inspecção visual e caracterização de migração de células de cancro por meio de um dispositivo de microfluidos compartimentalizar estão ilustrados na Figura 3 e Figura 4. A linha celular é BTSC. Com a nossa configuração actual, as imagens da fase de cultura de células pode ser continuamente registadas durante o tempo de 5 dias (Figura 3) e tão frequente como a cada 2 segundos (Figura 4). Além de 5 dias, meios de cultura precisam ser substituídos para a reposição de nutrientes e resíduos removidos. Nosso longo prazo lapso de tempo identifica uma seqüência rotativa de seis estágios celulares durante sua migração com base nas alterações morfológicas. Como ilustrailustrado na Figura 3, descreve-los como (i) pré-migração, (ii) a iniciação, (iii) o caminho-exploração, (iv) de cruzeiro, (v) destino exloration-e (vi) após a migração. Na câmara receptora, células fusiformes permanecer na etapa (i) como em tumores de massa que são capazes de crescer, dividir e migrar gradualmente. Ao se aproximarem da entrada de microcanais, algumas células prosseguir para o estágio (ii) quando se expandir e gerar saliência adesiva. Apenas um deles é capaz de ocupar a entrada e proceder à etapa (iii), o qual pode explorar a direcção da migração. Uma vez que a célula determina a direcção da migração, procede-se a fase (iv), para cruzar com os microcanais em uma velocidade constante e elevada, o que é realizado através do microcanal inteiro. No final de microcanais, o produto de células de fase (v), para explorar o espaço aberto da câmara de recepção, e, em seguida, a etapa (vi). Em microcanais, poder migrar é maioritariamente gerada por blebbing actividade como ilustrado na figura 4, semelhante ao da amebóide cell. Blebbing celular e deformação membrana são totalmente gravado aqui.
Figura 1. Esquema de fabricação de dispositivos microfluídicos. Todo o processo é realizado sobre uma bolacha de alça de 3 polegadas de silício por meio de uma técnica modificada de litografia suave. 3 mícrons de altura microcanais e marcadores de alinhamento são feitos como na primeira camada. Em seguida, com 250 um de espessura su-8 é spin-revestido, enquanto que as marcas de alinhamento são cobertos com fita adesiva, de modo que possam mais tarde ser acessível para mascarar alinhador sem visão de bloqueio por fotorresiste espesso. Assim, as características da câmara pode ser feita como a segunda camada e precisamente alinhada com a primeira camada. Selo PDMS é eventualmente moldada fora do mestre resultante.
Figura 2. Esquema de montagem do dispositivo e processo de sementeira de células. Cercada por PDMS e gllamela bunda, o espaço de cultura 3D é composto de câmaras, reservatórios e microcanais. A câmara é enchida com a semeadura da cultura de células, enquanto que a câmara de recepção é inicialmente preenchido com células livres de meios de comunicação. Os microcanais que se conectam entre eles fornecer trilha de células migrando de um lado para receber a semeadura lado.
Figura 3. BTSC migração através de microcanais. Superior: instantâneos de lapso de tempo mostrar uma única célula (destacado em verde) migra mais de 400 m do lado de semeadura para o lado de recepção. Toda a viagem leva cerca de 2 dias, envolvendo uma seqüência de alterações morfológicas celulares. A barra de escala é de 40 m. Abaixe: a representação dos desenhos animados de seis estágios de migração. Pré-migração (i): Na câmara de sementeira, as células fusiformes e divisível gradualmente migram ao longo uns dos outros. As células próximas raça entrada de microcanais uns com os outros, polarizando corpo celular e e xerting protrusão lamellipodia. Iniciação (ii): A célula migratória com a maior capacidade ocupa na entrada do canal, enquanto seus concorrentes vai recuar. Path-exploração (iii): As alterações das células migratórias para um modo amebóide com polaridade pouco. Este modo de migração é extremamente móvel e capaz de explorar caminho em todas as direcções por vesículas de membrana protuberâncias pequenas. Cruzando (iv): Uma vez que o percurso de migração é determinada, a célula se transforma em um modo adaptado amebóide mantendo uma saliência adicional grande posição para a frente. Desta forma, mantém uma célula de motilidade elevada, bem como uma orientação constante e velocidade. Destino-exploração (v): Ao fim de percurso, a célula diminui e desenvolve filopodias para explorar a câmara receptora para qualquer alvo invasão. Pós-migração (vi): Depois de entrar na câmara de recepção, a célula torna-se em forma de estrela e retém a motilidade elevada mas sem direcção determinada.
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. Figura 4 Instantâneos de lapso de tempo mostrar o ciclo de vesículas e membranas atividade deformação de um BTSC: (AB). iniciação; (BD). Expansão, (DF). Retração. As setas e curva-linhas representam a direção e localização da deformação da membrana, respectivamente. Os instantâneos são coletadas a cada 8 segundos.
Discussion
O dispositivo micro e gravação de imagem técnica apresentada aqui permite uma caracterização visual da morfologia celular durante a migração. Em comparação com os métodos convencionais existentes, a plataforma microfluídica apresenta vantagens de custo-eficácia, alto rendimento e flexibilidade de design. O sistema de visualização apresentado microscópico permite estudo e gravação de longo prazo a migração de células vivas. O recurso de lente motorizado faz com que seja possível controlar vários caminhos de migração de uma imagem de alta-resolução, sem perturbar a amostra.
Durante a montagem do dispositivo, o carimbo de PDMS não é permanentemente ligada ao lamela de vidro para a conveniência do revestimento PDL (passo 3.4). É crítico para conseguir uma boa vedação para o sucesso deste protocolo. Contaminação introduzida a partir da fabricação do dispositivo, tais como bolhas de ar no selo ou poeiras / detritos sobre o substrato, podem pôr em risco a ligação e provocar fugas de fluido. Portanto, TREATIng do dispositivo de uma maneira livre de poeira é importante para impedir a falha do dispositivo. Antes da PDL-revestimento, as lamelas de vidro são o ácido nítrico e a solução tratada PDL é centrifugada para eliminar as poeiras / detritos. Encontramos fita adesiva, álcool lavar, e banho de água muito útil na remoção de pó / resíduos do selo PDMS, se um quarto limpo não é acessível. Após o selo PDMS fazer contato com a lamela de vidro, batendo a marca delicadamente com uma pinça facilita o selo.
BTSCs podem ser enriquecidos a partir de amostras humanas sala de operação através de cultura em meio de esfera de células-tronco, similar à cultura de células estaminais neurais normais 10. BTSCs enriquecidos desta forma demonstrar estaminais célula-como propriedades, tais como a expressão de marcadores de células-tronco (CD133, nestina), a diferenciação de várias linhagens neurais (glial e neuronal), e iniciação do tumor em um modelo de ratinho imunodeficiente ortotópico com tão pouco como 100 células 18. Apesar de algum debate existe sobre purificaçãocação e manutenção de BTSCs 1, 19-21, esfera crescidos BTSCs melhor manter o fenótipo e genótipo do tumor parental 22-24.
O espaço compartimentado imita o ambiente fisiológico para a migração celular. Em nosso dispositivo, BTSC exibem uma forte capacidade de migração através de um espaço de tamanho limitado, regulando morfologia celular. Nossa caracterização das alterações celulares morfológicas indica o modo de transformações em uma seqüência etapa seis que podem modelar uma nova descrição detalhada possível de invasão BTSC do cérebro adjacente. Na fase inicial, as células ganhar uma quantia significativa de polaridade e gerar saliências adesivas para ancorar-se de forma eficaz no interior do microcanal. Uma vez que a ocupação célula do microcanal é estabelecida, ele converte para um modo de cruzeiro e mantém este modo para toda a viagem através de um microcanal. Nesta fase, a motilidade BTSC manter elevado e consistente direcção mas conservar a energia. Emterestingly, parece que um microcanal é restrita a uma célula de cruzeiro de cada vez, de tal modo que, quando um produto de células únicas para esta fase, recuo células outro do microcanal. Este mecanismo garante provável eficácia de tumor espalhando e evita o consumo excessivo de nutrientes em microcanais. Depois de completar a migração através do microcanal, uma célula recupera a sua propensão para saliências multidirecionais e posterior exploração alvos de invasão ou caminhos de migração novas. O dispositivo microfluídico compartimentalizando oferece um romance in vitro significa a criação de um microambiente para estudar infiltração BTSC de parênquima cerebral.
Este método pode ser facilmente adaptado para o estudo do cancro da célula tronco (CSC) e linhas de células migratórias derivadas de outros tipos de tumor. A cultura de células no dispositivo micro pode ser realizado em qualquer laboratório de biologia moderna que está equipado com uma incubadora e experiência de cultura de tecidos. Equipado com um su-8 master, PDMSfundição e montagem de dispositivos são viáveis com alguma formação fundamental em litografia macia. Além disso, a plataforma pode também ser estendido para outras aplicações, integrando com outros módulos funcionais tais como misturador de gradiente, padronização de superfície, de controlo de fluido e microeléctrodo.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
PAC é parcialmente financiado por uma subvenção para T32 NIH Universidade de Wisconsin Programa de Formação de Células-Tronco (PA Clark). JSK foi parcialmente financiado pela HEADRUSH Cátedra de Pesquisa do tumor cerebral, Loff Roger Memorial GBM Fundo de Investigação, e da Fundação UW / Neurocirurgia Pesquisa tumor no cérebro e Fundo de Educação. JCW e YH são parcialmente suportados pelo NIH concessão NIBIB 1R01EB009103-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), high glucose | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Ham’s F12 | GIBCO, by Life Technologies | 31765 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| B27 supplement minus vitamin A | GIBCO, by Life Technologies | 12587-010 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Antibiotic-Antimycotic (PSA) | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | GIBCO, by Life Technologies | PHG0313 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) , human recombinant | GIBCO, by Life Technologies | PHG0021 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Heparin sodium salt, from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H1027-250KU | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Laminin (natural mouse) | GIBCO, by Life Technologies | 23017-015 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | Brain tumor stem cell (BTSC) culture supplies |
| Stem cell medium |
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| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)/ Heparin |
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||
| Epidermal Growth Factor (EGF) |
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| Heparin |
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| su-8 photoresist | MicroChem Corp. | ||
| Silicon handle wafer | WRS Materials | 3P01-5SSP-INV | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| laminin | BD Biosciences | 50 μg/ml in PBS buffer for the final concentration | |
| Biostation IM | Nikon Instruments |
References
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