Summary
Проиллюстрируем использование постоянной силы осевой оптический пинцет для изучения механических свойств коротких молекул ДНК. По растяжение ДНК оси, мы минимизируем стерических помех и артефактов, возникающих в обычных боковых манипуляции, позволяющие нам изучать молекулы ДНК максимально коротким ~ 100 нм.
Protocol
1. Пинцет установки
- Излучение 1064 нм лазера расщепляется на два ортогонально поляризованных пучков. Один используется для манипулирования биомолекулы, а другой используется для калибровки (см. рис. 2).
- Интенсивность манипуляций пучка контролируется акустооптического дефлектора (АОД), в то время как позиция и направленность каждого пучка независимо управляется лучом зеркал и оптических телескопов, соответственно.
- Балки затем рекомбинируют с другой поляризационный сплиттер и обусловлено дальше, окончательный набор телескопической оптики слегка переполнять назад апертура объектива микроскопа. 50% от переполнения для калибровки пучка приводит к жесткой оптической ловушке, в то время как немного меньше фактором для манипуляции света, примерно на 20%, дает меньшую внимания, что выражается в большей работоспособным области линейного потенциала. Пучков плотно сосредоточены на PlanApo 60x/1.4 нефти объект микроскопом погруженияэффективная на образец клеток.
- Эта установка пинцетом сочетается с домом построили светлое микроскопа, который обеспечивает освещение от галогенной лампы фокусируется на образце камеры конденсатора. Образ светлого отделяется от лазерного света дихроичным зеркалом, а затем отображается на две камеры CCD. Один CCD действует в качестве основного средства получения данных и программного обеспечения срабатывает, чтобы дать точную частоту дискретизации, в то время как другие CCD используется для изображения одного застрял ссылкой микросфер, положение которого служит обратной связи системы управления для компенсации дрейфа в микроскоп.
- Образец грубо расположены по отношению к цели, этапе XY, а затем могут быть точно позиционируется встроенный трехмерный пьезо-сцене.
- Рассеянного вперед и передается лазерный свет собирается в конденсаторе светлое и фокусируется на фотоприемник. Полученный сигнал фильтруется через сглаживающим фильтром на частоте 100 кГц, усиливается иcquired на 200 кГц с использованием карты DAQ.
2. Калибровка видимый размер бисера, чтобы осевое положение
- Установите камеру для образца 9 с дисперсной решение диаметром 800 нм полистирольных микросфер разводят в фосфатным буферным раствором. Пусть сидят в течение 10-15 минут и затем слегка промыть буфером для удаления избытка микросфер.
- Найдите микросфер случайно застрял в покровного стекла и отрегулируйте высоту образца камере, пока микросфер составляет около 1 мкм ниже фокус для создания расфокусированным изображением.
- Для измерения видимый размер изображения, сначала найти центр микросфер использованием геометрических шаблонов функции в LabView.
- Далее, создания радиального профиля интенсивности микросфер путем усреднения 360 ° вокруг центра каждом поперечном сечении. Радиального профиля, что соответствует белое кольцо в каждом из светлого изображения, может быть установлен с квадратичной функции, чтобы найтиЯркость пик. Расстояние между этим пиком и центр могут быть использованы в качестве меры видимый размер шарика.
- Использование калиброванного piezostage, постепенно увеличивается осевое положение микросфер и получить изображение на каждом осевом положении с ПЗС-камерой.
- Повторите анализ изображения для каждого последующего изображения соотносить видимый размер микросфер с осевым расположения (см. рис. 3). Осевой разрешение получаемых методом составляет около 1,4 нм 7.
3. Сопоставление оптический потенциал редактора Луч
- Начните с коллинеарно согласования пучка манипуляции и калибровки пучка. Калибровки пучка должна быть около 50 мВт на задней отверстия объектива в то время как манипуляции луч должен быть значительно слабее, скажем, 10 мВт.
- С манипуляции луч выключен, ограничить свободный микросфер в намного жестче ловушку калибровки пучка.
- Теперь, включите маниpulation пучка. Поскольку манипуляция пучка гораздо слабее, чем калибровки пучка, осевое положение микросфер будет несколько возмущенных. В результате изменений в осевое положение может быть измерена с расфокусированным светлое изображение как уже описано.
- Выключите манипуляции пучка и с микросферами еще находятся в ловушке калибровки пучка, сдвиг осевой центр калибровки пучка путем регулировки телескопических объективов. Включите манипуляции луча, измерение последующим смещением микросфер и повторите.
- Ах перемещений может быть заговор против осевое положение в центре внимания калибровке пучка. Осевое положение соответствующее крупнейших смещения микросфер определяет центр линейной области оптической ловушке (см. рис. 4).
- Последним шагом в получении оптическая сила манипуляции пучка в зависимости от осевого положения требует тщательного измерения жесткостикалибровки пучка. Для получения этого переместите микросфер, захваченных калибровки пучка, около микрометра над поверхностью, регулируя телескопическим объективом в то время как манипуляции луч выключается.
- Запись тепловой осевое перемещение микросфер, измеряя интенсивность проходящего света с фотоприемника.
- Автокорреляции сигнала может быть установлен на одной экспонентой распада дать постоянной времени колебания,. Τ г
- Гидродинамический коэффициент трения ζ, микросфер могут быть исправлены на близость микросферы на поверхности 5,10. Жесткость калибровки ловушку дается формулой κ г = ζ / г τ (см. дополнительные материалы и B).
- Зная жесткость калибровки ловушки позволяет конвертировать ранее измеренное осевых перемещений в силу ƒ г = κ г Ах интеграции Тхис кривой дает пространственное отображение осевого оптического потенциала манипуляции пучка (см. рис. 4).
4. Растяжение образца ДНК
- Установите камеру 9, содержащих поверхностно привязанный молекул ДНК (<1 т.п.н.) и, наблюдая изображение светлое, поместить в центре внимания манипуляции луч чуть выше нерастянутом микросферы, регулируя телескопа. Затем отрегулируйте положение этапе, пока один из микросфер в ловушке.
- Примерно положение микросфер в центре плоскости XY оптической ловушке. Создать серию квадратных волн в LabView и отправить их в AOD, чтобы повторно включить лазерный луч включается и выключается. Тщательно контролировать интенсивность лазера и длительности на состояние, чтобы предотвратить нагревание образца камере. Как правило, использовать около 2 мВт мощности лазера (измеряется в задней отверстия объектива) и отправить импульсов 200 мс (на) и 500 мс (в выключенном состоянии). Амплитуда квадратных Wпр. направлены в AOD должно быть около 0,5 В.
- Смотреть микросфер, как ловушка многократно включается и выключается и обратите внимание, если лазер вызывает любое преимущественное направление для движения микросфер в. В то время как итеративно регулировки микросфер позиции в обеих X и Y направлении, управляя piezostage, случайное движение микросферы должны стать изотропно в плоскости XY, хотя и заметно ограничены, когда лазер включен.
- Далее, выровнять борт в направлении Z. Опять импульса лазерного луча и выключается в то время как, на этот раз, одновременно измеряя смещение микросферы осевые в реальном времени. Центр этапом в линейной области, которая является точкой, где смещение Z является наибольшей.
- После тщательного выравнивания в направлении Z, крайне важно, чтобы убедиться, что ловушка по-прежнему сосредоточены в плоскости XY. Если выравнивание XY изменилось, как XY и Z выравнивания должна быть повторена до микросфер сосредоточена правильно по всем тремосей.
- Для растяжения ДНК, наращивать интенсивность лазерного излучения, посылая сигнал напряжения на AOD, от 0 В до 0,5 В с шагом 0,025 В. В каждом шагу, записи 400 кадров в 100 кадров в секунду и среднее их для получения осевого смещения.
- Кривые силы расширения теперь могут быть построены и подходят к модифицированной модели WLC 11 (см. Дополнительные материалы B).
5. Представитель Результаты:
Мы представляем кривые силы расширения для двух последовательностей ДНК: 1298 б.п. и 247 б.п. последовательности, причем последний кратчайшие последовательности мы смогли растянуть воспроизводимо. Для коротких участков ДНК, обычные червеобразные сети (WLC) модель не объясняет полностью связь силу расширения, потому что в этих масштабах надо объяснить размерных эффектов и нулевое расширение сила, возникающая от границы ограничений. Измерения силы расширения, следовательно, должны быть пригодны с использованием модифицированного WLC модель, которая имеет дает эффектве длина настойчивость и нулевое расширение силу нужным параметрам, описанным далее в дополнительных материалах. При больших длинах контур двухцепочечной ДНК, эффективная длина настойчивости просто номинальная длина настойчивость (~ 50 нм) и нулевое расширение силой можно пренебречь. Однако, как контурная длина становится короче эффективная длина настойчивость снижается ниже 50 нм и ДНК, даже при нулевой силе, показывает значительное расширение.
Данных и соответствующего приступы кривые силы расширения показаны на рис. 5 для двух последовательностей. С модифицированной WLC подходит, мы определили эффективные длины настойчивость, чтобы быть 35 нм для 1298 б.п. ДНК и 25 нм на 247 б.п. ДНК. Для иллюстрации мы представляем одну из мер силу расширения кривых для каждой последовательности. На практике, можно было бы повторить измерения несколько раз и получить средний результат наряду со стандартными ошибками. Следует также отметить, тхат после получения каждой кривой крайне важно, чтобы убедиться, что микросфер остается в ловушке и правильно расположена в пределах линейного участка, в противном случае микросферы должны быть перестроены, как описано выше в протоколе.
Рисунок 1 Принцип осевого оптического пинцета. (Слева) Обычные оптические ловушки пинцетом вблизи фокуса. Шарик затем переехал в боковом покровное оказывать напряженность. (Справа) в осевой оптический пинцет, микросферы в ловушке от фокуса, в линейной области оптического потенциала. В этой конфигурации, полимер проходит под постоянным напряжением для ряда расширений. Кроме того, увеличение интенсивности лазерного излучения перемещается микросфер в осевом направлении.
Рисунок 2 Схематическое изображениеОсевой оптический пинцет Лазерный свет (1064 Nd: YVO 4). Делится на два луча, проходя через поляризационный светоделитель (PBS). Манипуляции луч, проходя через акустооптического дефлектора (АОД) и калибровка пучка может быть отрегулирована независимо с использованием телескопического объектива. Два луча, затем рекомбинируют с помощью другого PBS и сосредоточился на образец высокой цели НС. Одновременно, светлое освещение используется для отслеживания микросфер, проходит через образец, является инфракрасный (ИК) фильтром, а затем изображается двумя камерами CCD, один из которых выполняет измерения, а другой действует как часть системы управления с обратной связью.
Рисунок 3 Осевое положение калибровки. Для калибровки осевое положение, мы приобретаем расфокусированным изображений шарик застрял в камеру покровным на различных осевых позиций сцене. Размер микроскопииphere задается расстояние между центром и положение пика интенсивности о светлом кольцо, образованное вокруг изображения микросфер. На вставке представлены радиальные распределения интенсивности, которая дает размер шарика.
Рисунок 4 Принцип карт оптического потенциала. Чтобы наметить оптической силы манипуляции пучка, осевое смещение, что он индуцирует на микросфер в ловушке гораздо сильнее калибровки пучков измеряется. В центре линейного региона, где это смещение максимума находится. Оптическая сила по сравнению с осевой кривой позиция может быть интегрирована, чтобы найти оптического потенциала.
Рисунок 5 Силы Расширение Curve. Данных показан для случайного 1298 б.п. и 247 б.п. (вставка) сегментациит двухцепочечной ДНК растягивается осевого оптического пинцета. Данные пункты были пригодны для модифицированной модели WLC уравнения. 3 (сплошные линии) и дали эффективные длины сохранением 34 нм и 25 нм для 1298bp и 247bp соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обычные оптические пинцеты полагаться на аналоговые или с компьютерным управлением обратной связью, чтобы применить силу на постоянной рефрактильных объекта. Эти системы активной обратной связью испытывают трудности выполнения в условиях, когда внезапные изменения в расширение образца происходит, например, от связывание белка с ДНК или быстрое степпинг молекулярный мотор вдоль нити. Различные пассивные методы применения постоянной силы были недавно разработаны. Один из таких методов, используемых для решения степпинг РНК-полимеразы при разрешении пар оснований, участвует работает в линейной области оптического потенциала гауссова лазерного луча 12. Мы адаптировали этот метод для манипуляций короткие биомолекул путем создания постоянной силы осевого оптического пинцета.
Осевой оптический пинцет может быть использована для изучения короткие отрезки ДНК, которые недоступны для манипуляций обычными оптическими методами. Они были использованы в Санкт-Уды упругость коротких молекул ДНК, как маленький несколько сотен пар оснований 8 и для исследования эффектов упругого напряжения на белок-ДНК, опосредованное петли 13,14. На коротких масштабах длины, последовательности зависимых эффектов, связанных с изменениями в водородных связей и укладки энергии, может внести существенный вклад в упругие свойства ДНК. Осевой оптический пинцет являются идеальным инструментом для раскрытия этих последовательностей зависимых эффектов на ДНК эластичность 15. Кроме того, осевой оптический пинцет будет чувствительным инструментом для изучения упаковки ДНК вокруг отдельных гистонов и для зондирования деятельности любого быстро обработке молекулярный мотор, и окажется ценным новой техники в одной молекуле инструментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Yih-Fan Chen за помощь в осевой оптический пинцет и за вклад некоторых из его растяжения данных в этой рукописи. Эта работа была организована NSF гранта PHY-0957293 и FOCUS гранты PHY-0114336.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| Nd:YVO4 laser | Spectra Physics | T40-Z-106C | |
| Acousto-optic deflector | IntraAction | DTD-274HA6 | |
| Microscope Objective | Olympus | PlanApo | 60X, NA 1.4 |
| Piezo stage | Mad City Labs | Nano-LP100 | XYZ stage |
| CCD camera | PixeLink | PL-A741 | |
| Photodetector | Electro-Optics Tech | ET-3020 | |
| Polystyrene Beads | Spherotech | SVP-08-10 | 800nm, streptavidin coated |
| Anti-digoxigenin | Roche | 11333089001 | From sheep |
| Primers | MWG operon | Custom oligos | One primer: biotin Other : digoxigenin |
| PCR reagents | New England Biolabs | TAQ polymerase, dNTPs | |
| Coverglass | Fisher Scientific | ||
| Other chemicals for buffer | Fisher Scientific | ||
Supplementary Materials |
|||
A. Hydrodynamic Friction C–fficient |
|||
For determining the hydrodynamic friction c–fficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10: |
|||
where the following shorthand has been introduced: |
|||
The friction c–fficient is defined in terms of the fluid viscosity η and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance η above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms. |
|||
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration |
|||
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition. |
|||
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model |
|||
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows: |
|||
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 |
|||
where ε is the relative DNA extension.References
- Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D.
- Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches. Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).
- Kaplan, N. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Garcia, H. G. Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2006).
- Neuman, K. C., Block, S. M.
- Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C.
- Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers. Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).
- Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules. Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).
- Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol. Meiners Lab. , University of Michigan. (2011).
- Brenner, H. The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface. Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).
- Marko, J. F., Siggia, E. D.
- Greenleaf, W. J., Block, S. M. Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase. Science. 313, 801-801 (2006).
- Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment. Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).
- Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops. Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).
- Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules. , Forthcoming (2011).
