Summary
이 프로토콜은 세포를 추적할 수 있습니다 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 2D 및 3D 환경을 설정하는 데 사용 방법을 보여줍니다
Abstract
내생 전기 분야 (EFS)는 생체내 자연적으로 발생하며 중추 신경계의 1,2의 것을 포함한 조직 / 기관이 개발하고 재생하는 동안 중요한 역할을 재생합니다. 이러한 내생 EFS는 세포와 조직의 전기 저항과 결합 이온 수송의 셀룰러 규정에 의해 생성됩니다. 이것은 적용된 EF 치료는 동물과 인간 3,4의 척수 부상의 기능 복구를 홍보할 수 있다고보고되었습니다. 특히, EF의 감독의 세포 이주는 신경 전구 세포 (NPCs) 7,8 포함한 세포 유형 5,6의 다양한에서 입증되었습니다. 직류 (DC) EFS의 응용은 대부분의 실험실에서 일반적으로 사용 가능한 기법이 아닙니다. 우리는 세포와 조직 문화를 이전 5,11에 직류 EFS의 응용 프로그램에 대한 자세한 절차를 설명했습니다. 여기 2D를 설정하는 계산 필드 강도를 기반 표준 방식의 비디오 데모를 소개합니다NPCs에 대한 D 3D 환경, 그리고 2D에서 단일 세포 성장 조건에서 EF의 자극, 그리고 3D에서 organotypic 척수의 슬라이스에 세포 반응을 조사합니다. 척추 cordslice는 cytoarchitectonic 조직 조직도 이러한 문화 9,10 내에 보존되기 때문에 전직 NPC의 생체내 행동, 사후 이식을 공부하는 데 이상적인받는 조직이다. 또한이 전 생체내 모델은 또한 단일 세포 수준에서 촬영된 기록을 사용하여 생체내에서 세포를 추적할 기술적으로 가능하지 않습니다 수속을하실 수 있습니다. 그것은 비판적으로 2 차원 환경뿐만 아니라에서 셀 행동을 평가하는 것이 필수적뿐만 아니라 생체내 환경에서 mimicks 3D organotypic 상태입니다. 이 시스템은 수 체외 및 생체내 전직의 단세포 이주의 3D 추적과 조직 또는 장기의 문화에 커버 유리 기반 요리를 사용하고 월이면쪽으로 이동하기 전에 중간 단계가 될 수 고해상도 이미징조종의 패러다임.
Protocol
1. 신경 전구 세포 격리
- 추운 DMEM/F12 기초 중간에 E14-16 생쥐와 장소에서 전체 뇌를 해부. 35mm 배양 접시에 해부 현미경 및 전송 두뇌 아래의 모든 meninges를 제거합니다.
- 기계적 조직 파편에 머리를 해리 및 15 ML 관에게 전송하는 미세 집게를 사용하여 다음 파편을 제거하기 위해 3 분 동안 800 rpm으로 샘플을 원심 분리기.
- DMEM/F12 포함된 bFGF와 EGF를 추가하고 1 ML의 피펫으로 씹다.
- 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
- 2-5에서 flasks로 플레이트 전지 X 10 4 세포 / ML, 그때 전체 매체가 3 일 통과 세포에게 매 6 일 모든 변경 수행합니다.
- 적어도 5 구절 후에 다이제스트 neurospheres 단일 세포에 트립신과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 사용하고 poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic의 챔버 (2 아래에 설명된대로 준비)에서 성장. , N2 - 보충을 포함하는 성장 매체를 사용하여bFGF와 EGF는 항상 NPCs의 속성을 유지합니다.
2. electrotactic 챔버의 준비
- 다이아몬드 펜을 사용하여 반 22 X 22mm 1 호 두께 coverslips을 autoclaved 나누어 유리의 22 X 11mm 스트립을 준비합니다.
- gluing하여 내무부 크기 22 × 10 mm의 자유 서 유리를 만들기 함께 네 세로로 높은 진공 실리콘 기름 22 X 11mm 스트립 서. 완전히 마르도록 우물과 강화가 하룻밤 허용합니다.
- 다음 날, 실리콘 그리스를 사용하는 100mm 문화 요리의 기본에, 10 mm의 간격을두고 서로 평행하게 두 개의 22 X 11mm 유리 스트립을 첨부합니다. 중심에 가장 가까운 것이 22 X 22mm 커버 삼면이 기름과 함께 접시의 바닥에 부착된 각 끝에 슬립,지만을 배치하여 이러한 스트립 사이의 지역을 봉쇄하라.
- 잘 커버로 올라서 2.2에서 준비 유리 장소는 실내 벽이 퍼뜨리고을위한 제한된 공간을 만들 수 있도록 실수할접시의 바닥쪽으로 세포. 실리콘 기름과 방수 모두 관절. 코트 폴리-D-리신 후 laminin과 순차적이 협소한 지역 : 챔버로 한 ML는 폴리-D-라이신을 추가하고 폴리-D-라이신 판의 하단에 바인딩 수 있도록 5 분 동안 떠나, 챔버를 씻어 멸균 PBS로 두 번, 그리고 20 μg / ML을 양보하고 접시의 바닥을 충당하기 위해 사용하는 멸균 PBS에서 laminin을 희석. 하룻밤 동안 실온에 둡니다.
- 다음 날, 추수 세포 및 1 X 104 세포를 포함하는 정지 1 ML을 준비합니다. 완전히 건조 공기와 세포 현탁액 1 ML로 대체할 수 있도록 잘 유리에서 laminin을 제거합니다. 첨부를 허용하기 위해 4 시간 최소 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 세포가 충분히 합류가되면 챔버에서 모든 매체를 제거합니다. 조심스럽게 잘 유리를 제거합니다. 실리콘 그리스, autoclaved 22 X 22mm 유리 coverslip으로 신중하게 부착하여 세포를 통해 지붕을 형성두 22 X 11mm 스트립 사이에 브리지가. 밖으로 건조하지 않도록 매체의 몇 방울과 세포를 커버.
- 챔버 지붕 위에 접시 한 가장자리에서 다른 실행이 방수 실리콘 그리스 장벽을 만들어 챔버의 각 끝부분에 절연 매체 저수지를 형성하고 있습니다. 흐름을 관통 중간 저수지에서 서로에 대한 확보, 신선한 매체와 챔버를 채우십시오. 세포 회복을 할 수 있도록 12 시간 동안 인큐베이터에 요리를 반환합니다.
3. electrotactic 챔버에 대한 전기장의 응용
- 구멍, 마이 그 레이션 챔버의 각 저수지 위에 위치 하나를 뚫는하여 요리를 충당하기 위해 뚜껑을 준비합니다.
- 25 MM HEPES 버퍼를 포함하는 배지와 챔버에있는 모든 매체를 교체하고 온도 제어 영상 시스템으로 요리를 전송합니다. 시간이 경과 및 멀티 포지션 레코딩을위한 실험 매개 변수를 설정합니다. 음극과 양극이되도록 챔버 정렬오른쪽 각각 왼쪽에서 EF 벡터가 실행되도록 수평으로 현미경을 조회 및 이미징 시스템에 기록.
- 스테인 버그의 솔루션 (58 MM NaCl, 0.67 MM KCl, 0.44 MM 칼슘 (NO 3) 2 0.4 H 2 0, 1.3 MM MgSO 4 0.7 H 2 0 및 4.6 밀리미터 Trizma 기지, 산도 7.4)으로 두 비커를 채웁니다. 2퍼센트 (W / 가득 미리 준비된 유리 다리를 (~ 13cm 길이 ~ 3mm 직경 및 분젠 화염에 가열하여 U 자형으로 구부 러 유리 튜브)를 사용하여 각 매체 저수지로 별도의 비커를 연결 뚜껑에있는 구멍을 통과 V) Steinberg's-한천 솔루션. 스테인 버그의 솔루션의 각 비커에 DC 전원 공급 장치에 연결된 자세 / AgCl 전극을 배치하여 전기 회로를 완료합니다.
- 0과에서 전환 전원 공급 장치의 전압을 다이얼을 설정합니다. 전압 측정기를 사용하여 전압을 다이얼을 돌리면서 electrotactic 챔버를 통해 전압을 측정하고, 실험 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다.
- 촬영된 녹화를 시작합니다. 매체 변경을 수행하고 매 시간마다 필요에 따라, 전압을 정리하다. 필요에 따라 신선한 매체, 약물 또는 화학 약품은 저수지에 추가할 수 있습니다. 매체 변경을 수행하면 두 가지 옵션은 다음과 같이 생각할 수 :
- 옵션 1 호 - 일시적으로 정지 시간 저속도 녹음을 위하여는, 신중하게 커버 뚜껑을 perturbing 피하기 위해 챔버에서 유리 다리를 제거, 신선한 매체와 모든 매체를 대체할 부드럽게 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 유리 다리를 다시 넣어 다음 녹음을 재개하십시오.
- 옵션 2 호는 - 또는, 사용자는 또한 매체 변경 목적으로 사용할 수있는 4 홀 (두 마이 그 레이션 챔버의 각 저수지 위에 위치)로 커버 뚜껑을했다. 유리 교량 연결을위한 두, 다른 두 매체를 변경하기위한. 옵션 2는 매체 변화하는 동안 간섭없이 연속 녹화 가능합니다.
4. organotypic 척수 슬라이스의 작성
- lumb 해부이주 오래된 C57 BL / 6 생쥐의 AR 척수가 나란히있어.
- McIlwain 조직 헬기와 500 μm의 두께 부분으로 척수 코드를 썰어.
- 별도의 해부 현미경으로 조각하고 그대로 축 / 화살 척수의 구조와 조각을 선택합니다.
- Matrigel 단백질 생산 자체 조립까지 30 μl Matrigel 그리고 그것을 배치를 포함하는 35mm 배양 접시에있는 플레이트 조각 가능한 한 중심가에 가까이하고 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 그들을 유지 척수의 단면의 표면을 커버 박막. 그것은 완전히 다른 30 분 필요한 경우에 대해 37 ° C에서 페트리 접시를 품어 Matrigel이 조립되어 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다.
- 슬라이스에 직접 매체 흐름을 피하기 위해 25 밀리미터 HEPES 버퍼와 매우 부드럽게하므로 같은 15-20% 소태아 혈청을 포함하는 4-6 ML DMEM/F-12 매체를 추가하십시오. 슬라이스가 완전히 잘 노출 explants의 표면을두고, 중간에 빠져들되지 않았음을 확인공기. 주 2 회 매체를 변경합니다.
5. organotypic 척수의 슬라이스에 Hoechst 33342로 분류 NPCs의 분사
- 하나의 NPC 서스펜션 × 10 6 세포 / μl를 준비합니다.
- 30 분 5 μm의 Hoechst 33342와 함께 중간에 세포 현탁액을 사전 품어.
- 현미경으로 천천히 척수의 슬라이스로 정지 2 μl를 microinject하는 모세관 유리관을 사용합니다. 모세 유리관이 matrigel (현미경 빨간 부분)을 통과하고 척수의 단면 (현미경 회색 조직)의 내부에 도달했는지 확인, 달려든 세포 현탁액을 피하기 위해 최소 30 초 동안 척수 슬라이스 안에 남아 있습니다. 인큐베이터로 척수의 슬라이스를 포함하는 배양 접시 (37 ° C에서 5 % CO 2)를 넣고 하룻밤 동안 그것을 두십시오.
- 다음날, (에 설명된 방법을 사용 electrotactic 챔버에 33,342-라벨 NPCs Hoechst를 포함한 척수 슬라이스 500 MV / mm의 EF를 적용3).
6. 대표 결과
NPCs들은 음극쪽으로 높은 감독 셀 마이 그 레이션 (그림 1)을 보였다 생리 EFS의 범위에 노출되었을 때. 동일한 관측도 organotypic 척수의 슬라이스 전직의 생체내 모델, 생체내 조건에서 3D 환경 흉내낸 (그림 2)에서 단일 세포 수준에서 만들어졌습니다.
1 그림. NPCs은 EFS의 감독이 마이 그 레이션을 보여줍니다. EFS에 노출되면 PC는 음극쪽으로 높은 감독이 마이 그 레이션을 보여줬, 빨간색 라인과 파란색 화살표는 세포 운동의 궤도와 방향 (A) 나타냅니다. B는 NPCs의 마이 그 레이션 경로를 보여줍니다. 바 : 50 μm의.
그림 2. 이식 NPCs는 organotypic 척수의 단면에서 음극쪽으로 이동 마이 그 레이션을 보여
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Discussion
우리가 사용하는 프로토콜은 이전 연구 5,11에 바탕을두고 있습니다. 표준화와 정확한 차원 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 배양해 세포 또는 조각으로 한천 교량, 스테인 버그의 솔루션 및 자세 / AgCl 전극를 통해 EF을 적용하는 동안 이러한 방법을 사용하여 안정적인 문화와 전류 조건이 유지됩니다. 챔버의 깊이는 다른 예제는 11 두께에 대한 수용하도록 조정될 수 있으며, 세포의 경우, 챔버 크기는하지만 많은 세포 (예 : 서양 얼룩 분석은 많은 세포가 필요합니다) 필요한 수용하도록 수정할 수 있습니다. 우리는 단일 세포 수준에서 촬영된 기록을 사용하여 생체내에서 세포를 추적할 기술적으로 가능하지 않습니다 절차를 허용하도록 이러한 방법을 수정하고 개발했습니다. EFS에 대한 세포 반응에 관한 이전 연구의 대부분은, 2D 환경에서 실시되었습니다. 단일 세포 수준에서 NPCs의 electrotactic 응답의 생체내 연구어떤 생리적 관련성을 입증할 수있는 중추적인 증거를 제공합니다. 그러나 이것은 실시간으로 세포 마이 그 레이션 음반을 얻기 위해 노력 특히, 현재의 기술로 달성하기 위해 기술적으로 매우 어렵습니다. 우리는 면밀히 그림 2에 표시된, 세포가 여전히 3D 환경에서 electrotactic 응답을 가지고 있는지 보여주 생체내 환경에서을 흉내낸, 전직 생체내 organotypic 척수 슬라이스 문화 모델을 구축하기 위해 추가 조치를 취했습. 이 방법은 또한 대동맥 링이나 여자 CAM의 상피 조직의 상처 치유, angiogenesis로 organotypic 3D 환경 내에서 세포 유형의 다양한에서 EFS의 효과를 관찰 적합하고, 여자는 배아에서 아마도 유전적 영향 수 .
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 왕립 학회 URF 부여 UF051616, 영국 및 BS에 대한 유럽 연구 협의회 StG 보조금 243,261에 의해 지원되었다. MZ 연구실의 작업은 또한 재생 의료 보조금 RB1-01417의 캘리포니아 공과 대학에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | EMD Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
References
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