Summary
Denne protokollen demonstrerer metoder som brukes til å etablere 2D og 3D miljøer i spesialdesignede electrotactic kamre, som kan spore celler
Abstract
Endogene elektriske felt (EFS) forekommer naturlig in vivo og spiller en avgjørende rolle under vev / organ utvikling og regenerasjon, herunder at den sentrale nervesystemet 1,2. Disse endogene EFS er generert av mobilnettet regulering av ionisk transport kombinert med den elektriske motstanden i celler og vev. Det har blitt rapportert som gjaldt EF behandling kan fremme funksjonell reparasjon av ryggmargsskader hos dyr og mennesker 3,4. Spesielt har EF-directed celle migrasjon blitt vist i en rekke celletyper 5,6, inkludert nevrale stamceller (NPC) 7,8. Anvendelse av likestrøm (DC) EFS er ikke en vanlig teknikk i de fleste laboratorier. Vi har beskrevet detaljerte protokoller for anvendelse av DC EFS til celle og vevskulturer tidligere 5,11. Her presenterer vi en video demonstrasjon av standard metoder basert på et beregnet feltstyrke å sette opp 2D end 3D miljøer for NPC, og å undersøke cellulære responser til EF stimulering i begge encellede vekstvilkår i 2D, og organotypic ryggmargen skive i 3D. Den spinal cordslice er en ideell mottaker vev for å studere NPC ex vivo atferd, post-transplantasjon, fordi cytoarchitectonic vevet organisasjonen er godt bevart innenfor disse kulturene 9,10. I tillegg gir denne ex vivo modellen også prosedyrer som ikke er teknisk mulig å spore celler in vivo ved hjelp av time-lapse opptak på én celle nivå. Det er kritisk viktig å vurdere celle atferd i ikke bare en 2D miljø, men også i en 3D organotypic tilstand som mimicks in vivo miljøet. Dette systemet vil gi høy oppløsning med Cover glass-baserte retter i vev eller organ kultur med 3D sporing av én celle migrasjon in vitro og ex vivo og kan være en mellomliggende trinn før han går videre i VIVO paradigmer.
Protocol
1. Neural stamceller isolert
- Dissekere hele hjerner fra E14-16 mus og legg i kaldt DMEM/F12 basal medium. Fjern alle hjernehinnene under en anatomisk mikroskop og overfører hjerner inn i en 35 mm petriskål.
- Bruk fine tang til mekanisk dissociate hjerner i vev fragmenter og overføre dem til en 15 ml tube, så sentrifuger prøvene ved 800 rpm i 3 min for å fjerne rusk.
- Legg DMEM/F12 inneholder bFGF og EGF og triturate med en 1 ml pipette.
- Pass cellesuspensjonen gjennom en celle sil for å få en enkelt celle suspensjon.
- Plate celler i kolbene i 2-5 x 10 4 celler / ml, deretter foreta en full medium endre hver 3. dag og Passage cellene hver 6 dager.
- Etter minst 5 passeringer, fordøye neurospheres til enkeltceller bruke trypsin og EDTA og vokse på poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic Chambers (tilberedt som beskrevet nedenfor i to). Bruk den voksende medium med N2-supplement,bFGF og EGF til enhver tid å opprettholde egenskaper NPCer.
2. Klargjøring av electrotactic kammeret
- Forbered 22 x 11 mm striper av glass ved å dividere autoklaveres 22 x 22 mm no.1 tykkelse Dekkglass i halvparten med en diamant penn.
- Lag en frittstående glass godt av innvendige dimensjoner 22 x 10 mm ved liming sammen fire vertikalt stående 22 x 11 mm strimler med høy-vakuum silikonfett. La brønnene for å tørke og herde over natten.
- Dagen etter fest to 22 x 11 mm glass strimler, parallelt med hverandre forlate et gap på 10 mm, til bunnen av en 100 mm kultur rett med silikonfett. Tett av regionen mellom disse strimler ved å plassere en 22 x 22 mm dekkglass i hver ende, festet til bunnen av fatet med fett på tre sider, men ikke at nærmest sentrum.
- Plasser glasset godt forberedt i trinn 2,2 på dekselet glipper slik at innvendige vegger skaper et trangt sted for seedingcellene på bunnen av tallerkenen. Vann-proof alle skjøter med silikon fett. Coat dette begrenset region sekvensielt med poly-D-lysin deretter laminin: tilsett 1 ml poly-D-lysin inn i kammeret og la stå i 5 min for å la poly-D-lysin å binde seg til bunnen av tallerkenen, vask i kammeret med steril PBS to ganger, deretter fortynnes laminin i sterile PBS å gi 20 mg / ml og bruke til å dekke bunnen av tallerkenen. Forlat i romtemperatur over natten.
- Dagen etter innhøsting celler og forberede en ml suspensjon inneholder 1 x 104 celler. Fjern laminin fra glasset godt, slik at det å lufttørke fullstendig, og erstatte med en ml cellesuspensjon. Sett fatet i inkubatoren ved 37 ° C i minimum 4 timer for å tillate vedlegg.
- Når cellene er tilstrekkelig konfluent fjerne all medium fra kammeret. Fjern forsiktig glasset godt. Form et tak over cellene ved nøye å feste, med silikonfett, en autoklaveres 22 x 22 mm glass dekkglassbygge bro mellom de to 22 x 11 mm strimler. Dekk cellene med noen dråper medium for å unngå uttørking.
- Form en isolert medium reservoar i hver ende av kammeret ved å skape to vanntette silikonfett barrierer som går fra en kant av fatet til den andre, over kammeret taket. Fyll kammeret med friskt medium, noe som sikrer en gjennomstrømning fra ett medium reservoar til den andre. Tilbake fatet til inkubatoren i 12 timer for å tillate celle utvinning.
3. Anvendelse av et elektrisk felt til electrotactic kammeret
- Forbered et lokk for å dekke parabolen ved å bore to hull, ett plassert over hver reservoar av migrasjon kammeret.
- Erstatt alle medium i kammeret med kultur medium med 25 mm HEPES buffer og overføre fatet til temperaturkontrollert imaging system. Sett opp eksperimentelle parametre for time-lapse og multi-posisjon innspilling. Rett i kammeret, slik at anoden og katoden erpå venstre og høyre henholdsvis å sikre at EF vektor går horisontalt sett ned i mikroskopet og registrert i imaging system.
- Fyll to begerglass med Steinbergs løsning (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2 0.4 H 2 0, 1.3 mM MgSO 4 0.7 H 2 0 og 4,6 mm Trizma base, pH 7,4). Koble en separat begerglass til hvert medium reservoar ved hjelp av ferdigretter glass bruer glassrør ~~~HEAD=NNS 13 cm lange og ~ 3 mm i diameter, og bøyd i en U-form ved oppvarming i en bunsenbrenner), fylt med 2% (w / v) Steinberg's-agar løsning, passerer gjennom hullene i lokket. Fullfør elektrisk krets ved å plassere Ag / AgCl elektroder koblet til en DC strømforsyning i hver beger av Steinbergs løsning.
- Sett spenning skiven på strømforsyningen til 0 og skru på. Mål spenningen over electrotactic kammeret mens skru opp spenningen dial, ved hjelp av en spenning meter, og justere for å passe de eksperimentelle krav.
- Start time-lapse opptak. Utfør en middels endring og justere spenningen, slik det kreves, hver time. Fersk medium, narkotika, eller kjemiske midler kan legges til magasinene som er nødvendig. Når utfører medium endring, kan to muligheter vurderes som følger:
- Alternativ No.1 - Hvis du vil stanse time-lapse opptak midlertidig, fjerner glass broer fra kammer for å unngå perturbing lokk, bruker en sterilisert Pasteur pipette forsiktig erstatte alle medium med frisk medium og satte glasset broene tilbake, og gjenoppta innspillingen.
- Alternativ No.2 - Eventuelt laget custom cover lokk med 4 hull (to plassert over hver reservoar av migrasjon kammeret) kan også brukes til medium endring formål. To for glass broer tilkobling, de to andre for å endre medium. Alternativ 2 tillater kontinuerlig opptak uten innblanding under middels endring.
4. Klargjøring av organotypic ryggmargen skive
- Dissekere Lumbar ryggmargen av to ukers gammel C57 BL / 6 mus.
- Skjær ryggmargen til 500 mikrometer tykke seksjoner med en McIlwain vev helikopter.
- Separate skiver under en anatomisk mikroskop og velger skiver med intakt sagittal / axial ryggmargen struktur.
- Plate skiver i en 35 mm petriskål inneholder 30 mL Matrigel og plassere dem så nær sentrum som mulig og holde dem i en 5% CO 2 inkubator ved 37 ° C i minst 30 min før Matrigel proteiner selv montere å produsere en tynn film som dekker overflaten av ryggmargen skive. Det er svært viktig å sørge for at Matrigel har blitt montert helt, Inkuber petriskål ved 37 ° C for en annen 30 min hvis det er nødvendig.
- Legg 4-6 ml DMEM/F-12 medium med 25 mm HEPES buffer og 15-20% kalvefoster serum svært forsiktig slik at man unngår medium flyt direkte på skive. Sørg for at stykket ikke er helt nedsenket i medium, forlater overflaten av explants godt eksponert forluften. Endre medium to ganger ukentlig.
5. Injeksjon av Hoechst 33342 merket NPCer i organotypic ryggmargen skive
- Klargjør NPC oppheng i 1 × 10 6 celler / mL.
- Pre-inkuber cellesuspensjonen i medium med 5 mikrometer Hoechst 33342 for 30 min.
- Bruk kapillær glassrør til microinject 2 mL av suspensjon i ryggmargen stykket langsomt under et mikroskop. Pass kapillær glassrør passerer gjennom matrigel (rosa del under mikroskop) og nå til innsiden av ryggmargen skive (grå vev under mikroskop), forblir inne i ryggmargen skive i minst 30 sekunder for å unngå cellesuspensjon påkjørt. Sett petriskål inneholder ryggmargen skive i inkubatoren (37 ° C 5% CO 2) og la den over natten.
- Neste dag, gjelder en EF på 500 mV / mm til ryggmargen skive inneholder Hoechst 33342-merkede NPC i electrotactic kammeret (ved hjelp av metodene beskrevet i3).
6. Representative Resultater
Når NPCer ble utsatt for en rekke fysiologiske EFS de viste svært rettet celle migrasjon mot katoden (figur 1). Den samme observasjonen ble også gjort på en enkelt celle nivå på organotypic ryggmargen skive ex vivo-modell, en 3D-miljø etterligne in vivo forhold (figur 2).
Figur 1. NPCer viser rettet migrasjon i EFS. PCer viste svært rettet migrasjon mot katoden når de utsettes for EFS, røde linjer og blå piler representerer baner og retning av celle bevegelse (A). B viser migrasjonsveier av NPCer. Bar: 50 mikrometer.
Figur 2. Transplanterte NPCer viser rettet migrasjon mot katoden i organotypic ryggmargen skive
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollene vi bruker er basert på tidligere studier 5,11. Ved hjelp av disse metodene, stabil kultur og elektrisk strømforhold kan opprettholdes mens søknad en EF via agar broer, Steinbergs løsning, og AG / AgCl elektroder, til celler eller skiver dyrket i custom-designede electrotactic kamre av standardiserte og presise dimensjoner. Dybden kammer kan tilpasses for ulike utvalg tykkelser 11, og i tilfelle av celler, kan kammeret størrelse bli endret for å imøtekomme imidlertid mange celler er nødvendig (f.eks Western blot analyse krever mange celler). Vi har endret og utviklet disse metodene for å tillate prosedyrer som ikke er teknisk mulig å spore celler in vivo ved hjelp av time-lapse opptak på et enkelt celle nivå. Majoriteten av tidligere forskning på cellulære responser til EFS, har blitt gjennomført i 2D miljøer. In vivo studie av electrotactic respons av NPCer ved en enkelt celle nivåville gi avgjørende bevis for å underbygge enhver fysiologisk relevans. Men dette er teknisk svært vanskelig å oppnå med dagens teknologi, spesielt når jeg prøver å få sanntid celle migrasjon innspillinger. Vi har tatt ytterligere skritt for å etablere en ex vivo organotypic ryggmargen skive kultur modell, tett etterligne in vivo miljøet, viser at cellene fortsatt ha en electrotactic respons på en 3D-miljø, som vist i Figur 2. Denne metoden kan også være egnet for å observere effekten av EFS på et bredt spekter av celletyper innenfor en organotypic 3D miljø, slik som sårheling i epitelvev, angiogenese i aorta ringen eller chick CAM, og muligens genetiske effekter i kylling embryo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Royal Society URF UF051616 stipend, Storbritannia og European Research Council STG stipend 243261 til BS. Arbeidet i MZ lab er også støttet av en California Institute of regenerativ medisin stipend RB1-01417.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | EMD Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | BD Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
References
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
